聯(lián)合應(yīng)用小檗堿和二甲雙胍對(duì)miR-212介導(dǎo)的食管癌細(xì)胞遷移的影響

陳智 劉玉珍 齊博 劉尚國(guó) 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院胸外科二病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100；2食管癌研究所；3河南省神經(jīng)病學(xué)研究所)

根據(jù)臨床病理分型，我國(guó)食管癌多以鱗狀細(xì)胞癌為主〔1〕。食管癌具有高度侵襲性且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的主要方式。EMT即上皮細(xì)胞間質(zhì)化，是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞并獲得遷移和侵襲能力的生物學(xué)過(guò)程〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，micro RNA(miR)異常表達(dá)參與腫瘤生物學(xué)進(jìn)展〔3〕。人miR-212(has-miR-212)具有組織特異性，在不同腫瘤組織中表現(xiàn)為抑癌或促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織標(biāo)本中miR-212表達(dá)水平升高與術(shù)后轉(zhuǎn)移早、生存期短、預(yù)后不良顯著相關(guān)〔4，5〕；另外，雷帕霉素等特定信號(hào)通路抑制劑無(wú)法阻斷食管癌中miR-212高表達(dá)介導(dǎo)的促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的表型。中藥提取物小檗堿對(duì)食管癌細(xì)胞具有抗增殖、促凋亡、抑制遷移的作用〔6〕。二甲雙胍不僅能夠治療糖尿病，其廣譜的抗腫瘤活性〔7〕在其他腫瘤中已有報(bào)道。因此，本文旨在進(jìn)一步探討具有廣譜抗腫瘤作用的小檗堿與二甲雙胍聯(lián)合用藥對(duì)miR-212介導(dǎo)的食管癌細(xì)胞遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人食管癌KYSE-450細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物技術(shù)有限公司。新生胎牛血清(FBS)購(gòu)自Clark；RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自Corning；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素購(gòu)自索萊寶科技有限公司；小檗堿購(gòu)自上海源葉生物有限公司；二甲雙胍購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。人成熟型miR-212過(guò)表達(dá)慢病毒載體由上海吉瑪基因生物公司合成。單克隆兔抗E-cadherin、Vimentin、Twist1、GAPDH購(gòu)自CST公司。二喹林甲酸(BCA)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗免疫球蛋白(Ig)G抗體購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2藥物配置 小檗堿用DMSO溶解，配置成50 mmol/L的貯存液，-20℃保存，使用前解凍，并用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)的工作濃度。二甲雙胍用PBS配備，制成1 mol/L的貯存液，使用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度用PBS進(jìn)行稀釋。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%FBS和100 U青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、飽和濕潤(rùn)空氣、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%，用胰酶消化處理后，計(jì)數(shù)傳代。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2×105個(gè)KYSE-450細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種在6孔板中。根據(jù)上海吉瑪基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并用5 mg/ml的嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，從中篩選出能夠穩(wěn)定高表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)藥物處理后對(duì)細(xì)胞遷移的影響 按Transwell說(shuō)明書操作：①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化成單個(gè)懸浮細(xì)胞后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)；②向Transwell小室的上室內(nèi)加入細(xì)胞懸液(含1×105個(gè)細(xì)胞)，加入無(wú)血清的RPMI1640稀釋至200 μl；③下室加入600 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基，另外上室和下室中按比例加入稀釋過(guò)的藥物；④置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出小室；⑤將小室浸入4%多聚甲醛中固定15 min，結(jié)晶紫染色8 min，晾干，并吸走小室內(nèi)的液體，用棉棒將上室內(nèi)的細(xì)胞擦去；⑥每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選5個(gè)視野，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照，并計(jì)算各視野下的細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡法檢測(cè)藥物處理后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行處理48 h，用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度(根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作)。以每組30 μg的等量蛋白樣品上樣，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，再用5%的脫脂奶粉在常溫下封閉1 h，加入E-cadherin、Vimentin、Twist1(1∶1 000)等一抗4℃過(guò)夜，用TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗IgG(1∶8 000)室溫?fù)u床上孵育1 h，再洗膜30 min，除去未結(jié)合的二抗，最后根據(jù)說(shuō)明書按照1∶1配置電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液，用凝膠成像儀成像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小檗堿、二甲雙胍對(duì)miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組比，過(guò)表達(dá)miR-212后促進(jìn)了細(xì)胞遷移能力(P<0.05)。不同濃度小檗堿(10 μmol/L和20 μmol/L)作用于過(guò)表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞后，與miR-212組(未加藥處理)相比，呈濃度-劑量依賴性出現(xiàn)抑制細(xì)胞遷移能力的作用(P<0.001)。給予10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍處理后，與miR-212組(未加藥處理)相比，其抑制作用具有濃度-劑量依賴性，隨濃度增加抑制作用逐漸明顯(P<0.001)。見圖1、2，表1。

圖1 小檗堿對(duì)過(guò)表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

圖2 二甲雙胍對(duì)過(guò)表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.2小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合對(duì)miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響 過(guò)表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)〔(555.67±5.69)個(gè)〕顯著高于對(duì)照組〔(363.67±5.13)個(gè)，P<0.05)〕。 miR-212+10 μmol/L小檗堿組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)〔(419.32±4.00)個(gè)〕和miR-212+10 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)〔(504.27±5.29)個(gè)〕均顯著低于對(duì)照組，且顯著高于miR-212+10 μmol/L小檗堿+10 mmol/L二甲雙胍組〔(197.36±5.57)個(gè)〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

表1 小檗堿、二甲雙胍對(duì)過(guò)表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響個(gè)，n=3)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與miR-212組(未加藥處理)比較：2)P<0.05；下表同

圖3 小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合對(duì)miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3Western印跡法檢測(cè)藥物處理后E-cadherin、Vimentin、Twist1蛋白水平 與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-212組(未加藥處理)E-cadherin表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Vimentin、Twist1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；兩種藥物聯(lián)合處理后，與過(guò)表達(dá)miR-212組(未加藥處理)相比，E-cadherin表達(dá)明顯增加，Vimentin、Twist1的表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 Western印跡法檢測(cè)小檗堿和二甲雙胍對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 Western印跡法檢測(cè)小檗堿和二甲雙胍處理后對(duì)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要標(biāo)志是發(fā)生EMT。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，癌細(xì)胞之間的黏附性下降，發(fā)生解離，上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞的表型并由此增加遷移和侵襲的能力〔8〕。文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔9〕。miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA分子，并參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物學(xué)過(guò)程〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)水平對(duì)EMT發(fā)生有促進(jìn)或抑制作用〔11〕。miR-212定位于染色體17p13.3上，參與多種腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展。如在胰腺癌中miR-212表達(dá)上調(diào)作為促癌基因參與腫瘤發(fā)展〔12〕；相反，miR-212在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用〔13〕。本研究顯示miR-212的高表達(dá)水平能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)并干預(yù)食管癌細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)展，找到具有治療潛力的miRNA的靶點(diǎn)藥物，能夠提高食管癌臨床治療手段。

前期研究顯示，給予LY294002(磷脂酰肌醇三激酶抑制劑)、雷帕霉素(靶蛋白抑制劑)等腫瘤相關(guān)經(jīng)典信號(hào)通路抑制劑，不能抑制miR-212介導(dǎo)的促進(jìn)食管癌細(xì)胞遷移的能力。因此推測(cè)，miR-212過(guò)表達(dá)能夠激活下游多條信號(hào)通路，從而促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化過(guò)程。

小檗堿又名黃連素，具有抗炎、抗菌、抗糖尿病等〔14,15〕作用。二甲雙胍能夠抑制食管癌〔16〕、乳腺癌〔17〕等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其潛在的廣譜抗腫瘤活性也被廣泛研究。腫瘤的聯(lián)合用藥是指利用不同藥物之間的協(xié)同作用以取得比單一藥物更好的效果〔18〕，通過(guò)減低藥物劑量達(dá)到減少藥物毒副作用目的，并增強(qiáng)藥物療效，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，防止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔19〕。將廣譜抗腫瘤藥物小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合用藥，能有效地提高抗腫瘤藥物的活性，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

本實(shí)驗(yàn)表明，低劑量的小檗堿、二甲雙胍單獨(dú)處理miR-212過(guò)表達(dá)的KYSE-450細(xì)胞，未能有效抑制細(xì)胞遷移能力；將二者聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制作用顯著增強(qiáng)，表明低劑量的小檗堿與二甲雙胍聯(lián)合后，對(duì)高表達(dá)miR-212的KYSE-450細(xì)胞的遷移能力具有顯著的協(xié)同抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制食管EMT及抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達(dá)。