三磷酸腺苷結(jié)合盒G2調(diào)控肝癌細(xì)胞多藥耐藥的作用

趙鑫 陳樂(lè)彤 王靜 劉亮

(1河北省人民醫(yī)院超聲科，河北 石家莊 050000；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所)

肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)〔1〕。手術(shù)、介入治療、靶向藥物治療及放化療是目前肝癌的常規(guī)治療方法。一些晚期肝癌患者或因其他原因無(wú)法行手術(shù)、介入治療的患者，化療成為其主要的治療方法。影響肝癌化療效果的因素有很多，其中藥物的毒副作用及肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥是較重要的影響因素。探索肝癌多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制從而對(duì)其靶向干預(yù)，可以有效提高化療效果。目前研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒(ABC)在腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用〔2，3〕，可以有效降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥，其中ABCB1及ABCG2與腫瘤多藥耐藥關(guān)系最為密切〔4～6〕。ABCG2參與多種腫瘤的多藥耐藥形成，且是側(cè)腹群(SP)細(xì)胞主要標(biāo)志物〔7～9〕，參與腫瘤干細(xì)胞的形成；而ABCG2與肝癌多藥耐藥關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本文主要探討肝癌多藥耐藥形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 ABCG2(5D3)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch；碘化丙啶(LOT：5338528)購(gòu)自美國(guó)BD公司；FC500型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2肝癌耐藥細(xì)胞培養(yǎng) 利用藥物濃度遞增細(xì)胞培養(yǎng)方法建立肝癌耐藥細(xì)胞，在肝癌細(xì)胞SMMC-7721培養(yǎng)液中加入阿霉素(ADM)，逐漸提高ADM濃度，濃度從0.001 μg/ml 提高至0.100 μg/ml，使細(xì)胞在0.100 μg/ml ADM中穩(wěn)定生長(zhǎng)，命名為SMMC-7721/ADM 細(xì)胞。

1.3MTT法檢測(cè)ADM對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 將細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后棄去上清液，分別加入不同濃度的ADM(0.001、0.005、0.010、0.050、1.000、5.000、10.000、50.000 μg/ml)，陰性對(duì)照組加入等體積生理鹽水，每孔總體積為200 μl，同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔，每個(gè)藥物劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用24 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)液180 μl，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入180 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。以空白孔調(diào)零，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光密度值A(chǔ)490。生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：生長(zhǎng)抑制率(IR，%)=(1-用藥組A490/對(duì)照組A490)×100%。

1.4倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721/ADM及其親代SMMC-7721細(xì)胞形態(tài) 將細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 將細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM細(xì)胞，利用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，取1 ml細(xì)胞懸液，向其中加入DNA染液(碘化丙啶)1 ml，而后避光4℃染色30 min，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6FCM檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá) 將細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM細(xì)胞，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，取細(xì)胞懸液1 ml，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS懸浮細(xì)胞，100 μl ABCG2抗體加入細(xì)胞懸液中，室溫孵育30 min，而后PBS洗滌細(xì)胞1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS懸浮細(xì)胞，100 μl FITC標(biāo)記的二抗加入細(xì)胞懸液中，室溫避光孵育30 min，利用冷PBS洗滌1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞中蛋白表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADM抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，ADM作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC50)為(1.11±0.09)μg/ml。

2.2肝癌耐藥細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 利用藥物濃度遞增細(xì)胞培養(yǎng)方法，歷時(shí)3個(gè)月，使細(xì)胞在0.1 μg/ml ADM中穩(wěn)定生長(zhǎng)，命名為SMMC-7721/ADM 細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察SMMC-7721/ADM細(xì)胞形態(tài)更不規(guī)則，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞間隙增大，見(jiàn)圖1。

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADM抑制肝癌SMMC-7721/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50 不同濃度ADM作用SMMC-7721/ADM細(xì)胞24 h，IC50=(23.04±0.26)μg/ml。SMMC-7721/ADM細(xì)胞與其親代SMMC-7721細(xì)胞相比，對(duì)ADM的耐藥指數(shù)為20.76。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 SMMC-7721/ADM細(xì)胞凋亡率(0.82±0.12)%，與其親代SMMC-7721細(xì)胞凋亡率(0.84±0.14)%相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 SMMC-7721/ADM細(xì)胞周期G0/G1期(46.86±0.49)%、S期(38.71±2.66)%及G2/M期(14.43±2.17)%；SMMC-7721細(xì)胞周期G0/G1期(49.97±0.51)%、S期(37.85±2.31)%及G2/M期(12.18±1.79)%。SMMC-7721/ADM細(xì)胞與其親代SMMC-7721細(xì)胞相比G0/G1期顯著減少(P<0.05)；而S期及G2/M期增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6肝癌耐藥細(xì)胞及其親代細(xì)胞中ABCG2 蛋白表達(dá) 肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721/ADM中ABCG2 蛋白表達(dá)水平(377.58±3.01)顯著高于其親代細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)水平(332.50±13.96，P<0.05)。

3 討 論

目前引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制中研究較多且得到廣大研究者公認(rèn)的機(jī)制主要有三方面，第一，細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制；第二，凋亡調(diào)控基因調(diào)控機(jī)制，通過(guò)凋亡調(diào)控基因的調(diào)控使細(xì)胞逃脫藥物引起的細(xì)胞凋亡；第三，細(xì)胞酶調(diào)控機(jī)制。大量的文獻(xiàn)〔9～11〕顯示，細(xì)胞跨膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞藥物外排作用，引起細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度降低，從而引起細(xì)胞耐藥的機(jī)制與大量癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。細(xì)胞跨膜蛋白可以主動(dòng)逆濃度梯度將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出到細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞濃度。研究顯示，這類與細(xì)胞耐藥有關(guān)的跨膜蛋白多為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員〔10,11〕。而在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中研究較多的與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥有關(guān)的蛋白為ABCB1及ABCG2。

ABCG2與多種腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥有關(guān)〔12,13〕，參與了腫瘤SP細(xì)胞形成并與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)〔4,14〕。本研究結(jié)果顯示，SMMC-7721/ADM細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生耐藥，其耐藥機(jī)制考慮為細(xì)胞中ABCG2高表達(dá)從而引起外排ADM作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ADM的有效濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥。