Beclin1、p62和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌患者中的表達及意義

程新宇 周成美 孫潔 王露雪 王翠芳

(1沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110024；2錦州醫(yī)科大學)

自噬是細胞在生理狀態(tài)下適應環(huán)境的一種保護機制，自噬異常參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展病理過程〔1〕。自噬相關蛋白(Beclin)1和自噬底物蛋白(p62)是自噬相關基因。Beclin1可與磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C3或Vps34)形成自噬體，在調節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔2〕。p62是C-Myc編碼的一種多功能泛素化結合蛋白〔3〕，具有選擇性自噬功能，在一定程度上反映了自噬活性〔4〕；近年來隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現p62參與了自噬在內的眾多生命活動信號通路〔5〕，其表達和調控異常與多種惡性腫瘤密切相關〔6〕，增殖指數(Ki-67)是細胞增殖的重要標志，常可作為預測惡性腫瘤發(fā)展及預后的指標。本文旨在探討乳腺浸潤性導管癌(IDC)及癌旁組織中Beclin1、p62和Ki-67表達差異及其與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年1月至2017年12月沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院病理科79例IDC標本為觀察組，20例相應距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織標本為對照組，所有患者臨床病理資料存檔完整。年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤2 cm 26例，腫瘤直徑>2 cm 53例；組織學分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結轉移33例。所有患者經免疫組織化學檢測時未經放化療。

1.2試劑 通用型Beclin1和p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人單克隆抗體、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP)試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3SP法免疫組織化學染色 所有IDC患者腫物切除后使用10%的中性甲醛溶液固定，依據病理規(guī)定規(guī)范取材，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)石蠟脫水，檸檬酸抗原(pH6.0)高壓修復，室溫冷卻30 min；用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4沖洗3次，每次3 min，用油筆圈定玻片上的待測組織區(qū)域；每張切片均按SP法操作流程制作(其中第一抗體Beclin1或p62稀釋比為1∶200；第一抗體Ki-67為即用型，均4℃冰箱冷藏過夜)；DAB顯色，鏡下觀察后自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗反藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標本切片作陽性對照。

1.4結果判讀 所有免疫組化切片由兩位經驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法單獨判讀。Beclin1和p62陽性結果判讀標準：陽性表達為細胞質出現棕黃色顆粒。Ki-67陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞核。在高倍鏡下任意計數5個視野，每次選取200個細胞進行觀察，按陽性細胞所占百分比計分，評分標準為〔7〕:0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞<10%；2分為陽性細胞占10%～30%；3分為陽性細胞>30%。按染色強度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細胞百分比計分與染色強度計分的乘積≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman 等級相關分析。

2 結 果

2.1Beclin1、p62和Ki-67在IDC組織中表達 實驗組Beclin1陽性表達位于細胞質，呈棕紅色，陽性表達率〔44.3%(35/79)〕明顯低于對照組〔100%(20/20)，χ2=4.803,P=0.028〕；p62陽性表達位于細胞質，呈棕黃色，陽性表達率〔58.2%(46/79)〕明顯高于對照組〔10.0%(2/20)，χ2=6.532,P=0.011〕；實驗組Ki-67陽性表達位于細胞核，呈棕紅色，陽性表達率〔51.8%(41/79)〕明顯高于對照組〔5.0%(1/20)，χ2=7.389,P=0.007〕，見圖1。

2.2實驗組Beclin1、p62及Ki-67表達與臨床病理特征的關系 Beclin1、p62陽性表達在不同組織學分級、淋巴結轉移的IDC患者中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ki-67陽性表達在不同組織學分級的IDC患者中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表1。

圖1 IDC患者Beclin1、 p62、Ki67的表達(SP法，×100)

2.3實驗組Beclin1、 p62和Ki-67相關性分析 Beclin1和p62共同陽性表達14例，共同陰性表達12例，呈負相關(r=-0.330,P<0.01)；Beclin1和Ki-67共同陽性表達10例，共同陰性表達13例,呈負相關(r=-0.416,P<0.01)例；p62和Ki-67共同陽性表達30例，共同陰性表達22例，呈正相關(r=0.315,P<0.01)。

3 討 論

自噬相關蛋白表達失調可能是一種新的腫瘤發(fā)生機制〔8〕。Beclin1基因是哺乳動物中第一個被確認的自噬調控基因，在自噬過程中Beclin1能結合激活Vps34，形成Vps34-Beclin1復合體，對自噬泡的形成起關鍵調控作用，而Beclin1缺乏則嚴重影響自噬泡的形成〔9〕。Beclin1高表達能抑制腫瘤發(fā)展，失活則促進腫瘤發(fā)生〔10〕。本研究結果顯示Beclin1蛋白在IDC表達較癌旁正常乳腺組織明顯減低；且隨著組織學分級增加及淋巴結的轉移而Beclin1表達較少，提示自噬活性減低可能與IDC發(fā)生、發(fā)展有關。自噬相關蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發(fā)生時，p62首先與細胞質中泛素化蛋白結合，再與定位于自噬體內膜上微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)形成復合物，被自噬溶酶體降解。自噬過程中，p62蛋白在細胞質中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細胞質中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標記蛋白。雷程等〔11〕研究表明，p62蛋白在結腸癌組織細胞質中陽性表達明顯高于癌旁正常組織，p62高表達提示自噬活動減弱，促進腫瘤發(fā)展。劉婷婷等〔12〕研究發(fā)現p62在外陰鱗狀細胞癌的細胞質中表達明顯高于外陰正常皮膚，說明外陰鱗狀細胞癌自噬活動減弱促進了癌發(fā)生，與本實驗結果一致。本研究中p62異常聚集表明IDC自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細胞器和大分子物質得不到及時降解，導致活性氧大量產生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向IDC進一步轉化。

以往研究提示細胞內p62異常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信號〔13〕，反向調節(jié)自噬，起到促癌作用；近年來發(fā)現細胞內p62異常聚集，還可以激活核因子(NF)-κB和NF相關因子(Nrf)2兩個系統(tǒng)〔14〕。p62蛋白通過T6BD與腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6相互作用促進TRAF6的寡聚化，從而導致TRAF6的多聚泛素化及NF-κB活化〔15〕，NF-κB是一個轉錄因子蛋白家族，涉及細胞存活及分化，NF-κB信號途徑的激活對腫瘤細胞增殖及轉移非常重要；Nrf2是細胞內最重要的抗氧化應激調控通路穩(wěn)定細胞內環(huán)境〔16〕。當氧化應急持續(xù)存在時，p62與Nrf2競爭結合腫瘤抑制因子(Keapl)，使Nrf2入核，從而激活Nrf2靶基因轉錄，此時激活Nrf2保護了腫瘤細胞免受氧化性損傷使癌細胞生存能力增強。本研究表明p62表達與腫瘤的惡性行為相關，其高表達預示IDC惡性程度高，易發(fā)生轉移，是預后差的指標。Burdelski等〔17〕使用免疫組化技術檢測了前列腺癌組織中p62的表達，發(fā)現其表達與組織學分級及淋巴結轉移有關，與本實驗結果相似。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是評價惡性腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標。本研究提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發(fā)生轉移，預后較差。

本研究提示隨著腫瘤惡性程度增加自噬相關基因表達異常，細胞增殖更加活躍促進了腫瘤發(fā)生，且Beclin1和p62 與淋巴結轉移相關，提示自噬相關基因表達異常能夠預示IDC侵襲力強，易發(fā)生轉移，預后差，自噬相關基因是判斷IDC預后的又一有效指標。