基于Txnip/NLRP3/NF-κB信號通路的芍藥苷干預下半月板損傷修復的實驗研究

錢哲 繆文興 李林東

【摘要】目的 本研究目的在于探討靈芍藥苷對兔半月板修復作用機制。方法 采用手術技術建立兔半月板損傷模型，病理學檢測兔半月板組織，ELISA法檢測半月板損傷兔滑膜中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）炎性細胞因子水平，蛋白印跡法檢測半月板兔滑膜中Txnip/NLRP3/NF-κB通路蛋白的表達水平。結果 芍藥苷能顯著降低半月板損傷兔滑膜中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。芍藥苷可以顯著緩解半月板損傷兔半月板病理改變，芍藥苷可以抑制Txnip/NLRP3/NF-κB信號通路激活。結論 芍藥苷可以修復半月板損傷可能與調控Txnip/NLRP3/NF-κB通路的調節有關。

【關鍵詞】芍藥苷;半月板修復;Txnip/NLRP3/NF-κB

1 前 言

半月板損傷是由于外傷導致的不穩定和關節活動喪失引起的，它可導致疼痛或殘疾、關節退化和骨關節炎癥狀[1-2]。膝關節半月板沒有完全血管化，血液僅供給其結構的外三分之一，其自發修復的可能性有限[3]。大量研究表明半月板損傷與炎癥途徑密切相關，主要表現為體內炎癥細胞因子水平的變化的變化，主要包括白細胞介素-1（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α （TNF子-α），影響的途徑主要有NLPR3和NF-κB[4-5]。炎癥小體是一種大的多蛋白復合物，可作為白介素-1β和白介素-18的成熟胱天蛋白酶-1激活促發因子。它們根據其整體PRR家族成員的組成進行分類，這些成員作為支架蛋白促進胱天蛋白酶-1的募集、聚集和自動激活，最典型的炎癥體是NLRP3炎癥體。NLRP3既是支架蛋白，也是一種凋亡相關斑點樣蛋白，含有半胱天冬酶募集結構域（ASC）銜接子和半胱天冬酶-1。各種刺激通過硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）會引起NLRP3炎性通路的活化，誘導IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的釋放[6-7]。NF-κB是一種典型的促炎轉錄因子，含有p50/p65和IκBα。同時，研究表明NF-κB可以觸發和調節下游促炎細胞因子的轉錄和表達[8]。芍藥苷作為芍藥的有效成分具有多種藥理活性，包括抗癌、抗炎、抗肺纖維化抗痙攣作用[9]。然而芍藥苷對半月板損傷修復作用的潛在機制尚不明確。因此，本研究旨在進一步探討其在半月板損傷中的潛在機制。

2 材料與方法

2.1 試劑

芍藥苷購自購自天津萬象恒遠科技有限公司（中國，天津）。白細胞介素-6、白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的酶聯免疫試劑盒購自于南京科創生物技術公司 （中國，南京）。所有抗體均購自于Cell Signaling Technology （Danvers， USA）公司。

2.2 動物

動物60只成年新西蘭雄性白兔購自北京維塔爾有限公司，并根據動物倫理委員會機構指南在GLP實驗室的特定無病原體條件下飼養。動物被保存在常規的動物設施中，在22～24℃的恒定溫度下，在12小時的光照/12小時的黑暗循環環境中。將家兔隨機分為4組（每組15只）：正常組、半月板損傷（模型組）、模型組+芍藥苷（20，40 mg/kg）組。除正常組和模型組外，芍藥苷（20，40 mg/kg）組連續給藥7天。除正常組外，其余三組均進行手術。所有的手術都是在同一個手術室進行的，使用的是標準操作程序。動物外科中心由兩名資深外科醫生組成。外科手術肌肉注射50 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg塞來昔布麻醉。刮除每只動物的雙側膝蓋后，手術區域用碘/酒精消毒。在無菌條件下，前角和內側半月板體。后腿的左膝通過一個完整的關節切口暴露出來。髕骨外翻允許關節最大程度彎曲。在半月板前部做了一個2.0毫米的斜切口。全楔形缺損。半月板組織的一小部分被切除，留下一個有缺陷的區域。

2.3 滑膜中細胞因子測定

按照ELISA試劑盒說明書檢測各組別家兔滑膜中IL-1β、IL-6，TNF-α的含量。

2.4 半月板組織病理學

半月板組織固定在4%中性福爾馬林溶液中。然后將組織包埋在石蠟中，切成4毫米厚的切片。進行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡（200倍）下觀察觀察組織病理學變化。

2.5 蛋白質印跡

將組織置于含0.1%苯甲磺酰氟的冰冷RIPA緩沖液中溶解?？偟鞍缀坑肂CA蛋白檢測試劑盒定量。等量的蛋白用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳加載。室溫下，將從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移的聚偏氟乙烯膜在脫脂乳中封閉2小時以上。然后將聚偏氟乙烯膜與適當濃度的特異性抗體在4℃孵育過夜。第二天，在用TBST洗滌三次后，將聚偏氟乙烯膜與第二抗體在室溫孵育1小時。免疫反應帶與增強化學發光（ECL）試劑盒相互作用，并在凝膠成像系統上可視化。

2.6 統計學分析

所有實驗數據以均數±標準差表示，運用統計學軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 芍藥苷對半月板損傷兔滑膜炎癥細胞因子的影響

檢測滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。結果如表1所示，半月板兔滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯高于正常組（P<0.01）。芍藥苷（20，40 mg/kg）能顯著降低滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平（P<0.01）。

3.2 芍藥苷對半月板病理變化的影響

正常組兔半月板組織學分析觀察正常組織和細胞結構。半月板損傷模型組表現為滑膜水腫、炎性細胞浸潤和上皮變性。芍藥苷（20，40 mg/kg）顯著改善上述病理變化（圖1）。

3.3 芍藥苷對半月板Txnip/NLRP3/NF-κB通路的影響

與對照組相比，模型組 Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平升高（P<0.01），Trx水平較低（P<0.01）。與模型組相比，芍藥苷（20，40 mg/kg）能夠顯著降低Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平（P<0.01），升高Trx水平（P<0.01）（圖2）。

4 討 論

半月板損傷會影響膝關節功能障礙。然而目前尚缺乏促進半月板愈合的有效治療方法。雖然，關節鏡下切除半月板撕裂仍然是最常見的治療方法，但手術會導致膝關節表面暴露壓力增加，影響骨關節炎進展[10]。芍藥苷作為芍藥的有效成分，具有多種藥理活性[9]。然而芍藥苷對半月板損傷修復作用的潛在機制尚不明確。因此，本研究旨在進一步探討其在半月板損傷中的潛在機制。

TNF-α由單核細胞產生，具有免疫調節和炎癥調節作用。IL-1β是一種與組織破壞或水腫有關的促炎細胞因子。IL-6具有多種免疫調節功能，可增強機體的免疫功能[11]。研究證實半月板損傷的病理過程中始終伴隨著炎癥[12]，而患有炎癥時循環的促炎細胞因子可以引起膝關節滑膜的廣泛變化，例如IL-6、IL-1β及TNF-α。本實驗證實半月板損傷兔滑膜中炎癥細胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α顯著升高，芍藥苷（20，40 mg/kg）顯著降低滑膜炎癥細胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α。

NF-κB是一種經典的促炎轉錄因子，參與調節促炎介質生成的最重要因子之一[13]。此外Txnip/NLRP3也是調節炎癥的重要信號。本研究證實半月板損傷兔滑膜Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表達水平升高，Trx蛋白表達水平降低。芍藥苷（20，40 mg/kg）能夠使Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表達水平降低，Trx蛋白表達水平升高。綜上所述，芍藥苷對兔半月板損傷有抑制抑制炎癥反應的作用，其機制主要與調控Txnip/NLRP3/NF-κB信號通路相關。

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本文編輯：董 京