黑果枸杞離體快繁技術研究

王聰慧　王鐵軍　高芳　秦彩云　陳士剛　才巨鋒　陶晶

摘要：【目的】探討黑果枸杞的組織培養技術，為實現規模化高效離體快繁提供技術依據。【方法】以黑果枸杞當年生嫩莖為外植體，研究激素組合對黑果枸杞組培苗初代、增殖以及生根培養的影響。【結果】適合黑果枸杞初代培養的培養基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L ，腋芽生長良好，萌芽率達88.61%，且玻璃化情況較少;適合微枝增殖培養的培養基為MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，微枝生長速度快，增殖倍數可達4.8倍，少見玻璃化現象，且苗生長健壯，葉片嫩綠;適合微枝生根的培養基為1/2MS + IBA0.2mg/·L，生根率達98%。適宜的移栽基質為營養土∶河沙∶蛭石=3∶1∶1（體積比）。【結論】黑果枸杞嫩莖離體培養和莖芽增殖可以獲得再生植株實現離體快繁，本研究結果為黑果枸杞優良種質規模化繁殖提供了技術支持。

關鍵詞：黑枸杞;組織培養;增殖培養;生根培養

中圖分類號：S567.19文獻標識碼：A文章編號：1006-8023（2019）02-0032-05

Micropropagation of Lycium ruthenicum Murr

WANG Conghui?1， WANG Tiejun?2， GAO Fang?1， QIN Caiyun?1， CHEN Shigang?1， CAI Jufeng?1， TAO Jing?1*

（1. Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences， Changchun 130033; 2. Jilin Dunhua Forestry Bureau， Yanbian 133700）

Abstract：[Objective] To develop tissue culture technique for theLycium ruthenicum?， and provide technical basis for large scale and efficient in vitro rapid propagation. [Method] In this study， using tender stem ofL. ruthenicumas explant， the effects of different factors on primary culture， subculture and rooting culture were studied. [Results] The results showed that： the suitable medium for axillary bud sprouting was MS + 6-BA1.0mg·L?-1 + NAA0.2mg·L?-1， in which the axillary bud germination rate reached 88.61% and the vitrification were rarely. The suitable medium for proliferation was MS + 6-BA 0.1mg·L?-1 + NAA0.2mg·L?-1， in which the plantlets grew quickly. The proliferation rate was 4.8 times， and there was no vitrification with robust seedling. The suitable medium for plantlet rooting was MS + IBA0.2mg·L?-1， in which the rooting rate reached 98%. Suitable transplanting substrates were nutritional soil ： river sand ： vermiculite = 2：1：1. [Conclusion] The in vitro culture and stem bud subculture ofLycium ruthenicumcan be used to obtain the in vitro rapid propagation of the regenerated plants. The results provide technical support for the large-scale propagation of the fine germplasm ofLycium ruthenicum.

Keywords：?Lycium ruthenicum?; tissue culture; multiplication culture; rooting culture

0引言

黑果枸杞（?Lycium ruthenicumMurr.）為茄科（Solanceae）枸杞屬（?LyciumL.）灌木?[1]。可適應鹽堿荒地和鹽化沙地生存，是我國荒漠區特有的抗鹽抗旱野生植物，同時具有很高的經濟價值及營養價值?[2-3]。其果實含有17種氨基酸?[4]，13種微量元素，具有較高的營養價值和藥用價值?[5-8]，被譽為“軟黃金”?[9-10]。

由于具有較高的價值，大量的黑果枸杞野生資源被采集，導致野生資源難以自我恢復，分布迅速面積減小?[11-12]。黑果枸杞的扦插技術較為成熟?[11-13]，但扦插技術繁殖周期比較長。盡管黑果枸杞離體快繁技術具有一定的進展?[14-15]，但距離規模化快速繁殖還有一定距離。本研究旨在研究黑果枸杞腋芽增生途徑的離體快繁技術，為規模化繁殖苗木提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料與方法

1.1.1外植體消毒方法

供試材料為寧夏黑果枸杞當年生嫩枝。將當年生嫩枝去除葉片，用洗滌劑水沖洗15 min，再用自來水沖洗1～2 h 后剪成2～3 cm 長莖段（每塊莖段帶1～2個腋芽），置于超凈工作臺中，先用75%的乙醇溶液中浸泡15～20 s后，用無菌水洗凈3～5次，再放入10%次氯酸鈣溶液中消毒15 min，用無菌水沖洗3～5次，用滅菌后的濾紙吸干莖段表面水分待用。

1.1.2初代培養

將消毒后的黑果枸杞嫩枝分別接種于MS培養基中，培養基內含6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）。培養基內均附加蔗糖20 g/L和瓊脂5.5 g/L，高溫高壓滅菌前將pH調節至5.75～5.80之間。每瓶接種5個外植體，每處理20個瓶，35 d后統計其生長情況。培養室溫度23 ℃，初代培養與增殖培養時光強度為1 000～1 600 lx，生根和移栽培養時光照強度為1 600～2 000 lx，每天光照培養16 h，暗培養8 h。

1.1.3增殖培養

選取初代培養長勢良好的組培苗，以MS為基本培養基，培養基內含6-BA（0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）。其他條件同1.1.2，35 d 后統計試驗結果。

1.1.4試管內生根培養

選取長勢良好的組培苗用于生根培養試驗，將增殖培養后的健壯小苗截成2.5 cm長莖段接種在含有IBA（0.05、0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培養基上，培養基內均附加蔗糖20 g/L、NAA0.2 mg/L 和瓊脂5.5 g/L，高溫高壓滅菌前將pH調節至5.75～5.80之間。每瓶接種5個外植體，每處理20個瓶，15 d統計其生根率及根數。

1.1.5組培苗移栽

在培養室內打開培養瓶瓶口煉苗2～4 d，選取生根狀況良好的植株移栽于營養缽內，移栽前洗凈小苗上沾有的培養基，用0.1%多菌靈浸泡根系，營養缽內培養基質為營養土∶河沙∶蛭石（體積比）=3∶1∶1。基質使用前需要121 ℃ 高溫高壓滅菌20 min，移栽前0.1%多菌靈噴灑基質，移栽后用保鮮膜遮蓋置于23 ℃自然光培養7 d ，然后置于1 600～2 000 lx光照強度下培養， 10 d后統計成活率。

1.2數據統計與分析方法

試驗數據用Excel 2003進行統計，根據所得數據計算平均值、增殖率等;利用SPSS 19對數據結果進行方差分析等。

2結果與分析

2.1黑果枸杞嫩芽的初代培養

不同濃度的 6-BA 和 NAA 組合，對腋芽的萌發影響差異顯著（表1）。當6-BA濃度較低時，整體呈現發育緩慢和長勢弱的現象，當6-BA濃度較高時，整體呈現玻璃化現象。初代培養時，腋芽在MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上第7天開始萌動，生長狀況良好，腋芽呈嫩綠色，基本無玻璃化現象，25 d后萌發率可達88.61%，顯著高于其他組合。

2.2黑果枸杞嫩芽的增殖培養

不同濃度NAA與6-BA組合對增殖倍數的影響差異顯著（表2）。當6-BA濃度升高到0.2 mg/L時，開始出現玻璃化現象，如圖1（a）所示。當NAA和6-BA 濃度均較低時組培苗表現出長勢弱和葉片發黃的現象，如圖1（b）所示。在6-BA和NAA的9個組合中，較適合組培苗增殖培養的培養基為：MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，在該培養條件下可使黑枸杞組培苗增殖培養達到最佳效果，如圖1（c）所示。

2.3IBA對黑果枸組培苗生根影響

把增殖培養得到的微枝接種到生根培養基上，7 d 后，開始生根。15 d 后大量生根。不同處理的平均生根率之間差異顯著（表3）。隨著IBA濃度的增加，組培苗的生根率及生根數量呈增加趨勢，且根系的生長狀況逐漸變好。當IBA濃度為0.05 mg/L時生根率較低，如圖2（a）所示。當IBA濃度為0.2 mg/L時，黑枸杞組培苗的生根培養效果最佳，如圖2（b）（c）所示，生根率達98%，生根數也最多。

2.4組培苗移栽

黑果枸杞組培苗在營養土∶河沙∶蛭石（體積比）= 2∶1∶1的基質中成活率最高（93%左右），新生根豐富，該基質為適宜培養基質。

3討論

黑果枸杞組培苗在生長過程中易出現玻璃化現象，據文獻報道很多種植物的組織培養過程中都存在玻璃化問題?[14-17]。黑果枸杞的玻璃化問題的原因可能是前期培養條件不適引起的，且部分處理激素濃度不適導致。適合黑果枸杞初代培養的培養基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，萌芽率達88.61%，且玻璃化情況較少。

植物生長調節物質是組織培養中重要的組成部分，其濃度和比例是組織培養是否成功的關鍵因素之一。在本研究中適合組培苗增殖培養的培養基為MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，組培苗生長速度快，增殖倍數可達4.8倍，基本無玻璃化現象，且苗生長健壯，葉片嫩綠。

IBA廣泛應用于生根培養過程中，本研究中，進行黑果枸杞生根試驗時，在1/2MS 培養基中， IBA濃度為0.2mg/L時，黑枸杞組培苗達到適宜的生長狀態，即培養基配為1/2MS + IBA 0.2mg/L，在該培養條件下，組培苗生根率高達98%，根數為8.1，且根系粗壯，基本無愈傷組織。這與生長素的機理有關系，適宜濃度的IBA能夠促進根的分化。

4結論

適合黑果枸杞初代培養的培養基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，腋芽生長良好，萌芽率達88.61 %，且玻璃化情況較少;適合組培苗增殖培養的培養基為MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，組培苗生長速度快，增殖倍數可達4.8倍，基本無玻璃化現象，且苗生長健壯，葉片嫩綠;適合組培苗生根的培養基為1/2MS + IBA0.2mg/L，生根率達98%。適宜黑果枸杞的移栽基質為營養土∶河沙∶蛭石（體積比）=3∶1∶1。本研究建立了黑果枸杞高效的離體快繁技術，為規模化繁殖提供技術支持。

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