表面增強拉曼光譜技術檢測食品及農產品中的非法添加劑

段貴嬌，張健偉，張志彬，駱延平

(廣東環凱微生物科技有限公司，廣東 廣州，510663)

食品添加劑是為改善食品品質和色、香、味,以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的物質。我國基于相應原則制定了關于食品添加劑的使用標準，規定食品添加劑的最大使用量及其最大殘留量[1]。盡管國家有相關規定，但濫用食品添加劑仍時有發生，引發人們對于食品安全的擔憂。

傳統檢測食品添加劑的方法包括高效液相色譜(HPLC)[2]、液質聯用(LC-MS)[3]、氣相色譜(GC)[4]及氣質聯用(GC-MS)[5]等。這些方法靈敏度高、重復性好，但操作復雜、檢測時間長、易損傷樣品。隨著社會的發展，人們越來越渴望能方便、快速對食品添加劑進行檢測，近年來迅猛發展的表面增強拉曼光譜技術恰好滿足了這一需求。

20世紀初，印度科學家C.V.拉曼(Raman)發現了拉曼散射效應，可根據其進行物質的分析，但拉曼散射效應極其微弱，難以準確捕捉到拉曼信號，因此限制了拉曼光譜的發展。經過半個世紀的發展，1974年, FLEISCHMAN等[6]發現吸附在粗糙銀電極表面上的單分子層吡啶具有異常增強的拉曼信號。之后隨著技術的不斷發展，研究者們發現在納米貴金屬表面或者顆粒體系能夠使得拉曼信號得到顯著的增強，即表面增強拉曼效應(surface enhanced raman scattering, SERS)，進而大力促進了拉曼光譜在化學分析中的應用。由于其可提供目標分子的指紋圖譜(高特異性)，具有操作簡單、儀器易便攜化、用量少、不損壞樣品、靈敏度高等特點，在醫療衛生、食品安全(如圖1)、案件偵查等領域有著非常廣闊的應用前景。本文主要講述了表面增強拉曼光譜技術在檢測食品非法添加劑方面的應用，綜合了幾年來熱點新聞報道的食品安全問題，將各種非法添加劑按照其化學及藥理性質進行分類，主要從豬肉、牛羊肉及肝臟中的β-受體激動劑，豬肉、禽肉和動物性水產品中的硝基呋喃類藥物，水產品中孔雀石綠，肉類產品中鎮定劑，乳制品中的三聚氰胺這五個方面進行闡述。

圖1 表面增強拉曼光譜在食品添加劑檢測中的應用Fig.1 The application for SERS in the detection of food additives

1 豬肉、牛羊肉及肝臟中的β-受體激動劑

β-受體激動劑一般都具有舒張氣管平滑肌的作用，在醫學上用來治療哮喘等氣管性疾病，當此類藥物用于畜牧業時，有明顯的促進生長、提高瘦肉率及減少脂肪的作用，因此這類藥物常被當做瘦肉精來使用。由于其適用范圍及安全性，目前國際上各國頒布的限制法令不盡相同，而我國已明確限制其在畜牧業中使用，本文主要詳述了鹽酸克侖特羅、苯乙醇胺A及萊克多巴胺3種非法添加劑的檢測。圖1是幾種常見β-受體激動劑的分子結構，由圖1可以看出，它們都均有苯環等具有較強拉曼信號的官能團，因此可以利用SERS來對其進行高特異性和高靈敏度的檢測。

圖2 幾種β-受體激動劑的分子結構Fig.2 The molecular structure of several β-receptor agonists

1.1 鹽酸克侖特羅

鹽酸克侖特羅俗稱瘦肉精，添加在飼料或飲用水中可明顯提升瘦肉率，而人食用這種肉后可能導致中毒。我國自2002年9月10日起禁止在飼料及動物飲用水中使用該添加劑。李明心等[7]創建了以膠體Au納米顆粒和Au@Ag核殼納米顆粒為基礎的表面增強拉曼光譜免疫層析分析法(SERS-ICA)，并將其用于對鹽酸克倫特羅的高靈敏度檢測；其中鹽酸克倫特羅檢測的靈敏度為0.01 ng/mL，檢出限為6×10-5ng/mL。甘盛等[8]以納米銀(AgNPs)溶膠為SERS基底檢測鹽酸克倫特羅等β-受體激動劑于給藥和停藥期間在豬尿液、毛發和組織中等的濃度；其中鹽酸克倫特羅等幾種瘦肉精在標準溶液中的檢出限0.05 μg/L，尿液、血液中為1 μg/mL， 糞便、毛發以及肌肉等組織為1 μg/kg；該檢測方法便捷靈敏，適用于研究β-受體激動劑在生豬體內的代謝。XIE等[9]以Au-MBA@Ag-Ab為探針，預處理時溶液中游離的鹽酸克侖特羅與預先涂布在ICA條帶上的鹽酸克侖特羅競爭性地與抗原結合，隨后通過檢測測試線上SERS強度來檢測鹽酸克侖特羅含量；該實驗檢測鹽酸克侖特羅的IC50和檢測限(LOD)值分別為0.02 ng/mL和0.24 pg/mL，且實驗一般在15 min內就可以完成，可以達到快速、靈敏的檢測效果。

1.2 苯乙醇胺A

苯乙醇胺A(PA)亦可被稱之為瘦肉精，在我國同樣禁止添加于動物飼料及飲用水中。LI等[10]以Au-MBA@Ag-Ab 為探針，與苯乙醇胺A特異性結合后，通過SERS檢測到PA。這種新型的免疫層析法(ICA)的IC50及LOD值分別為0.06 ng/mL和0.32 pg/mL，能快速、準確地檢測尿液樣品中的PA，也可用于其他食品添加劑的檢測。

1.3 萊克多巴胺

萊克多巴胺作為一種新型人工合成的β-受體激動劑，作用與鹽酸克侖特羅、苯乙醇胺A類似，也屬于瘦肉精的一種，我國自2011年12月5日起禁止生產、銷售該物質。竇斌[11]以55 nm的納米金(AuNPs)溶膠作為SERS活性基底，檢測豬毛提取液中的萊克多巴胺；在堿性條件下,沙丁胺醇的檢測限達到50 ng/mL。翟福麗等[12]以AuNPs為SERS基底，檢測豬尿樣中的萊克多巴胺，得出標準溶液的最低檢測濃度為0.1 mg/mL， 分析時間小于30 min，基本滿足迅速、靈敏地檢測萊克多巴胺。YU等[13]以AuNPs為SERS活性基底，將其與鹽酸克倫特羅及萊克多巴胺兩種物質的抗體結合，進而檢測到游離的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺；在該實驗中兩種檢測物競爭性地與納米探針結合，實現了多重抗體的SERS檢測；該方法的檢測限(LOD)為1.0 pg/mL，在食品添加劑檢測方面具有很大的應用潛力。

表1 SERS檢測3種β受體激動劑類藥物分子的比較Table 1 Comparison of three β-receptor agonist drugs

2 豬肉、禽肉和動物性水產品中的硝基呋喃類藥物

硝基呋喃類藥物作為廣譜抗生素，對大多數細菌、真菌及病原體有強烈的殺滅作用。但該類藥物及其代謝產物對人體有致癌和致畸胎的副作用，因此我國于2010年將呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃西林4種硝基呋喃類藥物列為違法添加劑。XIE等[14]以50 nm的AuNPs為SERS活性基底，通過特征性SERS峰對呋喃丹寧和呋喃他酮進行SERS定性分析；在1 420 cm-1和1 456 cm-1處的峰可以用來區分混合物中的兩種化合物；在最佳條件下，檢測限可達5 ppm。竺芯宇等[15]分別用Au溶膠和Fe3O4@Ag(Ag殼厚度為40 nm左右)為基底檢測4種硝基呋喃類藥物(N1呋喃唑酮，N2呋喃妥因，N3呋喃西林，N4呋喃他酮)；以Au溶膠為基底時N1、N2、N4的檢測限最低可至5 ppm，由于N3的結構特殊性無法與Au結合，導致無法檢測出；以Fe3O4@Ag為基底時四種物質檢測限最低可達0.1 ppm。呋喃他酮一般難以直接檢測，但是其代謝產物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)能通過SERS進行檢測，LI等[16]制備了針對AMOZ和4-巰基苯甲酸(MBA)雙重標記的膠體GNP(如Ab-Au-MBA)的單克隆抗體(mAb)用作免疫探針，能快速測定AMOZ；該法的IC50值和檢測限(LOD)分別為0.04 ng/mL和0.28 pg/mL，該免疫探針與其他3種硝基呋喃類藥物沒有交叉反應性。利用SERS對豬肉、禽肉和動物性水產品中硝基呋喃類藥物進行檢測，可以實現快速、準確的檢測，并且靈敏度高、特異性強，故可廣泛應用于食品添加劑的檢測。

3 水產品中孔雀石綠

孔雀石綠是人工合成的有機化學物質，對細菌、真菌以及病原體等有一定的殺滅作用，可用于水產養殖[17]。但孔雀石綠長期超量的使用會對人體有致癌作用，故此我國明令禁止添加[18]。余婉松[19]以55 nm金溶膠為SERS活性基底，對7種不同魚肉(羅非魚，鯧魚、烏鱧、草魚、鯽魚、魚、花鰱)中孔雀石綠及其代謝物進行檢測，靈敏度在2～10 ng/g，相比傳統的色譜法，具有快速，無需特殊樣品前處理等復雜步驟。顧振華等[20]利用孔雀石綠的拉曼光譜特征峰(432～437 cm-1、1 166～1 170 cm-1、1 613～1 617 cm-1)及其強度,快速對孔雀石綠進行定性定量檢測，檢測限為5.0 μg/L，相比傳統的方法，具有特異性強，抗干擾能力好等優點。SUN等[21]設計制備具有PMMA/Ag/石墨烯/Ag/石墨烯雜化結構的高柔韌性且高靈敏度的SERS薄膜，可直接與待測樣品進行吸附；試驗中以其為SERS基底，檢測魚表皮的孔雀石綠的含量，5 min內完成檢測，且靈敏度高達10-7mol/L，非常適用于食品添加劑的檢測，由于石墨烯的引入，穩定了貴金屬納米銀的性質，得到了更加穩定的拉曼增強信號，在保證靈敏度的同時，大大增強了檢測的重現性。

4 肉類產品中鎮定劑

鎮定劑具有抗焦慮、鎮定、改善抑郁癥及改善睡眠質量的功效，吩噻嗪類藥物作為其中一種，在我國動物源性食品中禁止檢出，但因其能有效降低動物運輸過程中的死亡率且間接起到增肥作用，仍有不法商人使用，因此高效監測肉類食品中鎮定劑變得愈加迫切。

目前，國內外已有吩噻嗪類藥物及其代謝物的相關報道。如魏晉梅等[22]應用高分辨率液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)測定牛肉中包括氯丙嗪、乙酰丙嗪及甲苯噻嗪在內的24種鎮靜劑類獸藥殘留量，各藥物的LODs在0.2～2.5 μg/kg，定量限(LOQ)在0.5～5 μg/kg。孫雷等[23]利用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)檢測豬肉和豬腎中殘留的10種鎮靜劑類藥物，檢出限為0.5 μg/kg。FLEISCHMANN等[6]應用液相色譜-質譜聯用(GC-MS)檢測豬組織中4種鎮定劑含量，檢出限在0.5～10 μg/kg。齊士林等[24]利用超高效液相色譜-電噴霧電離質譜(UPLC-ESIMS/MS)對動物源食品中氯丙嗪、異丙嗪及其代謝物做了測定，檢出限在0.3～1.5 μg/kg。此外，吳寧鵬等[25]利用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法(UPLC-QTOF)篩查飼料中11種鎮靜劑類藥物，飼料基質中檢出限為0.1 mg/kg。盡管有檢測方法眾多，但靈敏度普遍不高，難以滿足肉類食品中添加劑的檢測需求。

而SERS技術靈敏度高、檢測快速且簡便，將SERS技術應用到肉類食品中鎮定劑的檢測將會極大地提升檢測的靈敏度和準確性。目前，SERS技術用于肉類中鎮定劑的檢測報道很少，說明SERS在這方面的研究具有較大的潛力。

5 乳制品中的三聚氰胺

三聚氰胺，俗名蛋白精，因對人體有害，被限制用作食品添加劑。由于食品工業中蛋白質含量的檢測存在一定缺陷，因此被不法商人用作提升蛋白質含量的指標，給人們的身心帶來極大的創傷[26-28]。三聚氰胺由于含有三嗪類含氮雜環結構，SERS信號比較強，可直接進行SERS檢測。楊欣等[29]為比較牛奶中三聚氰胺表面增強拉曼光譜法與國標法(GB/T 22388—2008/第二法液相色譜-質譜/質譜法)的差異，分別用表面增強拉曼光譜檢測法和國標法檢測牛奶中的三聚氰胺，結果表明，兩種方法在陽性樣品的判定上結論一致；其中表面增強拉曼光譜法的平均回收率和精密度分別為117.3%和13.2%，在709 nm左右處出現三聚氰胺特征峰；該方法操作簡單、方便快捷，可用于收購原奶及市場監督等環節的檢測。楊青青[30]以銀納米粒子膠體為SERS増強基底來檢測溶液中的三聚氰胺，以高濃度NaCl為聚沉劑，用NaOH將待測液pH調至堿性，實驗中三聚氯胺的線性檢測量為0.01～4.80 mg/L，相關系數為0.998， 回收率為94.4%～102.8%，該方法適用于牛奶及奶粉中三聚氰胺的快速測定。GIOVANNOZZI等[31]以金納米顆粒為SERS活性基底，定量檢測液體奶中三聚氰胺的含量，檢測限為0.17 mg/L，實驗提取程序較少，能有效用于檢測牛奶中的三聚氰胺。

6 展望

表面增強拉曼光譜技術雖起步較晚，但因其快速、操作簡單、靈敏度高、無損、可定性定量分析等優點迅速應用于諸多領域。盡管如此，表面增強拉曼色譜仍存在一些問題亟待解決。

就表面增強拉曼色譜發展歷程來看，從發現拉曼散射到應用SERS技術經歷了半個多世紀，直至21世紀才真正得以廣泛應用。究其原因，無外乎兩點：儀器設備不夠先進、SERS理論研究較落后。第一點現如今的科學技術已能應用SERS技術進行分析檢測，但發展空間還很大，比如向更便攜、低成本的方向努力。針對第二點，目前科學界提出幾種主要的觀點：基于分子金屬成鍵作用和光誘導電荷轉移作用的化學增強機制以及基于表面鏡像場、表面等離子體共振和避雷針效應的電磁場物理增強機制，而這兩種觀點還只是理論模型，科學界尚未達成共識，有待后人繼續努力。而將SERS技術應用于分析領域，關鍵是制備結構均勻、性質穩定、增強能力強的基底。傳統的拉曼光譜雖然具有很好的定性能力，但是樣品分子的拉曼信號一般都很弱，遠遠不能滿足樣品分子的痕量檢測。貴金屬納米粒如金、銀等周圍存在電磁場，當樣品分子靠近這個電磁場的時候，拉曼信號被很大程度地增大，從而使極微量的樣品分子也能被檢測得到，這種現象就是表面增強拉曼現象。但是，由于貴金屬納米粒子周圍磁場分布是不均勻的，在一定程度上，距離納米粒子越近的地方，磁場越強，增強效果越好，而處于溶液狀態的樣品分子距離納米粒子的距離有大有小，造成了信號增強能力的差異，此外，納米粒子不同的團聚程度，也會導致磁場分布不均，使檢測到的拉曼信號不穩定。基于以上問題，如果我們將貴金屬納米粒子制備成均勻性好、穩定性強的SERS基底，所檢測到的拉曼信號將大大增強，同樣地，所制備的拉曼基底如果具有很好的局域表面等離子共振效應，具有很強的電磁場，那么得到的檢測靈敏度也將大大提高。而在檢測食品添加劑時，由于SERS基底僅能捕捉到部分基團(含有N、S等雜原子，硝基、氨基、羧基等基團以及多芳環或雜環的大共軛體系)的信號，而對其他許多基團沒有響應，此時可能利用標記拉曼信號分子的方法來進行樣品的檢測[32-35]。

因此在將來，我們不僅需要克服以上缺點，還應加大SERS理論研究，研發更加方便、快捷和穩定的便攜式儀器。如果解決了以上缺點，拉曼由于具有特殊的指紋圖譜(定性好)、原位、無損、快速、靈敏等優點，將很好地解決目前檢測手段中存在的問題，甚至是替代傳統的技術成為食品安全檢測中的強有力和主流的技術手段，如(1)利用便攜式拉曼光譜進行食品安全的現場快速篩查；(2)通過光纖的靈活性和傳導性，進行食品樣品的遠程檢測；(3)進行非法食品添加劑種類的快速鑒別；(4)進行食品安全的基礎研究，如利用拉曼的原位檢測和物質結構發生改變后產生相應的拉曼指紋圖譜的變化，進行非法食品添加劑對人體產生危害的毒性機理的研究和證明；(5)進行非法食品添加劑添加到食物后產生作用的機理，或者是非法添加劑添加到食品后產生有毒物質的機理等進行研究；(6)同時也可將SERS技術與其他技術聯用，如將SERS與色譜技術進行結合，即可發揮SERS定性能力強，靈敏度高的優點，又可結合色譜的強大分離能力；再如將SERS技術與微流控芯片技術進行結合，可實現檢測的高靈敏、高特異性、高通量、微型化檢測，這將使SERS技術在食品添加劑分析檢測領域發揮著越來越大的作用。