橄欖油中甘油二酯異構體測定方法研究與應用初探

魏瑤，鐘其頂*，王道兵,3，李國輝

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(全國食品發酵標準化中心，北京，100015) 3(山東金勝糧油集團有限公司，山東 臨沂，276000)

甘油二酯(diacylglycerols, DAGs)是甘油三酯(triacylglycerols, TAGs)中1個脂肪酸酯基水解生成了羥基的脂質物質，包含1個甘油骨架和2個脂肪酸殘基。DAGs是天然植物油脂的微量成分及體內脂肪代謝的內源中間產物，在食品行業、化工行業和醫藥行業等領域均具有很多應用[1-4]。DAGs有2種同分異構體，分為1,2-DAGs與1,3-DAGs，這2種異構體是由于脂肪酸在甘油主干鏈上的連接位置不同而形成的[5]，其中1,2-DAGs是植物油中天然的中間體，是TAGs合成或降解過程中的中間產物，而1,3-DAGs是由1,2-DAGs經酶反應或化學異構化得到，有研究表明，溫度、PH和酰基遷移酶的存在等都會影響1,2-DAGs向1,3-DAGs的轉化[6-7]，當二者達到穩定時，1,3-DAGs與1,2-DAGs的比例在6∶4～7∶3，由于分子的空間效應，1,3-DAGs在熱力學上更加穩定[8]。經過了精煉和長期存儲的植物油中1,3-DAGs的含量會有明顯的增長趨勢，1,3-DAGs含量的增加或者1,3-DAGs/1,2-DAGs值的增加與植物油感官質量的降低有關[9]。因此DAGs異構體的含量比例特征可用于植物油的質量鑒別[10]。

當前對DAGs的檢測方法主要有薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)結合MALDI-TOF[11-12]或ESI-MS法[13-15]，其中，TLC法成本低且操作簡易，但缺點是精度不高，重復性差[16]；HPLC法雖然簡便快捷，但檢出限受限，故常用于分析人工制備得到的甘油二酯含量，而對植物油樣品中本身微量甘油二酯檢測效果不佳[17]。然而該2種方法均只能檢測出油脂中甘油二酯總量，且檢出限通常高于1 mg/mL。 氣相色譜法是常用的快速測定油脂中DAGs的方法，ISO 29822:2009規定了測定油脂中甘油二酯異構體的GC-FID方法[18]，而ZHU等認為由于相關標準品的短缺難以直接引用ISO方法，故而應用EI-MS和EI-MS/MS方法定性分析了橄欖油中DAGs異構體的特征[6]，PEREZ等在此基礎上研究了橄欖油存儲溫度和時間對DAGs異構體的影響[19]。然而，我國對DAGs的分析與應用主要集中在制備方法和功能研究領域，對微量DAGs異構體的研究報道較少[20-24]。

本研究在ZHU等和ISO方法定性分析的基礎上，引入定量分析的研究[25-27]。借助GC-MS對DAGs異構體進行定性分析，通過GC-FID方法進行定量測定，降低了對分析儀器的要求，以利于為實際應用中大批量的樣品檢測節約成本。優化了衍生條件，最后研究了初榨橄欖油和精煉橄欖油中DAGs異構體含量特征的異同，以及實現了1,3-油酸二酯的精確定量，旨在為我國橄欖油市場監管及產品標準制定提供基礎數據和技術支持，這對促進我國橄欖油標準與國際接軌，保護我國食用油市場有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種新鮮初榨橄欖油和4種精煉橄欖油，來自意大利的真實樣品；氮氣(純度為99.99%)，北京北溫氣體制造廠；丙酮、甲苯和異辛烷(色譜純)，DUKSAN Pure Chemicals公司；異丙醚(分析純)，上海麥克林生物化學有限公司；乙醚(分析純)，天津市津東天正精細化學試劑廠；N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺(MSHFBA)，Fluorochem公司；1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混合標品、1,3-油酸二酯標品、1-甲基咪唑、1 000 mg/6 mL二氧化硅SPE小柱，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Agilent6890氣相色譜儀、FID檢測器，安捷倫科技(中國)有限公司；GC-MS-QP2020氣質聯用儀，島津企業管理(中國)有限公司；DB-5ht氣相色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.1 μm)，安捷倫科技(中國)有限公司；電熱恒溫加熱箱，北京福意聯電器有限公司；MTN-2800D氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；十萬分之一電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標品衍生

稱取約0.01 g的1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混標以及1,3-油酸二酯單標，精確至0.1 mg，用甲苯配成10 mg/mL 的標準溶液，分別取50 μL氮吹至干后，加入100 μL甲基硅烷化衍生劑V(1-甲基咪唑)∶V(MSHFBA)=1∶20，使衍生質量濃度為5 mg/mL(保證衍生劑過量)，充分搖勻后密封，置于30 ℃恒溫箱中靜置衍生，衍生結束后加入900 μL丙酮，分別用GC-MS和GC-FID測定。

1.3.2 樣品處理

SPE過程：二氧化硅SPE小柱先用4 mL甲苯活化。取橄欖油樣品0.1 g溶于1 mL甲苯中，渦旋1 min， 移至SPE二氧化硅硅膠柱中。用2 mL甲苯淋洗后，加3.5 mL異辛烷/異丙醚混合液(體積比為85∶15) 洗脫含有TAGs的疏水化合物，重復1次后，加3.5 mL乙醚洗脫含有DAGs的極性成分，重復1次，收集含DAGs的洗脫液氮吹至干。

樣品衍生：氮吹至干后稱重，以5 mg/mL的衍生質量濃度加入甲基硅烷化衍生劑V(1-甲基咪唑)∶V(MSHFBA)=1∶20，進行衍生反應，充分搖勻后密封，置于30 ℃恒溫箱中靜置衍生，衍生結束后加入900 μL丙酮，分別用GC-MS和GC-FID儀測定。

1.3.3 GC方法

GC-FID與GC-MS氣相色譜條件：DB-5ht氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.1 μm)；升溫程序：初溫180 ℃ 保持2 min，以15 ℃每分鐘增加到330 ℃，保持15 min；載氣(N2)流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1；進樣口溫度260 ℃。

GC-MS質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV； 傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度200 ℃；燈絲電流80 μA；質量掃描范圍m/z200～650；掃描間隔時間1 s。

2 結果與分析

2.1 橄欖油中甘油二酯特征峰的確定

由于構成甘油二酯的脂肪酸可以多種多樣，而可以購買到的DAGs異構體標準品只有4種，不足以對橄欖油中DAGs特征峰定性，因此用GC-MS進行定性分析。對1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混標以及1,3-油酸二酯單標的衍生物用GC-MS測定，得到其主要質譜特征峰的EI-MS圖(圖1)，其中[M-15]+離子(M-表示對應甘油二酯衍生物特定基團上的分子質量或分子式)在棕櫚酸二酯的626m/z出現，在1,3-油酸二酯離子質譜檢測范圍(200～650m/z)未出現，因此[M-15]+離子可作為定性棕櫚酸二酯的特征離子。[M-RCO2CH2]+只在1,3-DAGs中出現，可作為1,3-DAGs的特征離子，用于區分甘油二酯異構體的構型。[RCO]+與[M-90-153]+僅在1,3-油酸二酯中出現，可作為判別1,3-油酸二酯的部分特征離子。另外，[M-RCO2]+在1,3-油酸二酯的411m/z出現，且強度最高。[RCO2+58]+在1,2-DAGs結構中強度明顯高于1,3-DAGs結構。綜上，可以通過[M-RCO2CH2]+離子區分1,2-DAGs與1,3-DAGs；通過[M-15]+、[M-89]+、[M-RCO2]+、[RCO2+58]+、[RCO]+與[M-90-153]+離子判斷DAGs種類。

通過對橄欖油樣品分析，對照表1和圖2中各種甘油二酯異構體標品的特征離子種類和對應的相對豐度，確定了橄欖油中幾種主要的特征DAGs異構體的種類以及在GC-MS和GC-FID色譜圖中的出峰順序，確定了1,2-油酸棕櫚酸二酯、1,3-油酸棕櫚酸二酯、1,2-油酸二酯和1,3-油酸二酯的保留時間分別為13.9、14.2、15.18、15.51 min，這與ZHU等的研究結果相符[6]。

A- 1,2-棕櫚酸二酯衍生物；B-1,3-棕櫚酸二酯衍生物；C-1,3-油酸二酯衍生物圖1 棕櫚酸二酯和油酸二酯異構體甲基硅烷衍生物的EI-MS圖Fig.1 EI-MS spectra of dipalmitin and diolein isomers

表1 不同的甘油二酯標品衍生物特征碎片離子和相對豐度Table 1 Characteristic EI-MS fragment ions and the relative abundances observed in various DAG standards

離子種類1,2-棕櫚酸二酯1,3-棕櫚酸二酯1,3-油酸二酯[M-15]+626(54)626(22)N/D[M-89]+551(8)550(8)602(18)[M-RCO2]+385(65)385(18)411(100)[RCO2+58]+313(100)313(18)339(36)[M-RCO2CH2]+N/D371(100)397(82)[RCO]+N/DN/D265(31)[M-90-153]+N/DN/D449(13)

注：N/D即未檢測到。

2.2 衍生條件優化

分別研究衍生時間和衍生溫度對測定結果的影響。由于相關標品短缺，不能對全部相關DAGs異構體都進行定量，因此即對所需異構體總的峰面積進行分析。由圖3可知，當溫度一定時，衍生60 min達到穩定。

a- 1,2-棕櫚酸二酯標品衍生物峰；b-1,3-棕櫚酸二酯標品衍生物峰；c-1,2-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰； d-1,3-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰；e-1,2-油酸二酯樣品衍生物峰；f-1,3-油酸二酯樣品衍生物峰；g-1,3-油酸二酯標品衍生物峰圖2 DAG標品及新鮮橄欖油樣品的GC-FID對比圖.Fig.2 GC-FID comparison of DAG standards and fresh virgin olive oil sample

圖3 新鮮初榨橄欖油在不同時間和溫度衍生下的DAGs衍生物總峰面積曲線圖Fig.3 The peak area of all DAGs derived from fresh virgin olive oil at different time and temperature

衍生時間均達到60 min時，溫度為20 ℃，衍生反應不完全，溫度為30 ℃與60 ℃時，穩定情況下峰面積無差異，衍生反應完全。因此，在保證衍生劑過量的情況下，橄欖油的最佳衍生條件為：衍生60 min，溫度30 ℃。

2.3 GC分析甘油二酯

2.3.1 標準曲線

稱取約0.1 g的1,3-油酸二酯、1,2-和1,3-棕櫚酸二酯混標標準品，精確至0.1 mg，用甲苯溶解配制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的標準溶液，分別取1 mL標準溶液氮吹至干并進行衍生反應后，加丙酮復溶為1 mL，用分別用GC-MS與GC-FID進行檢測后，以峰面積和質量濃度作標準曲線。

由表2可知，GC-MS方法中1,2-棕櫚酸二酯、1,3-棕櫚酸二酯和1,3-油酸二酯在0.1～0.9 mg/mL質量濃度范圍內，線性良好，相關系數均大于0.898，按信噪比S/N=3計算，檢出限分別為：0.015、0.013、 0.015 mg/mL。按信噪比S/N=10計算，定量限分別為：0.049、0.043、0.049 mg/mL。

GC-FID方法中1,2-棕櫚酸二酯、1,3-棕櫚酸二酯和1,3-油酸二酯的在0.1～0.9 mg/mL質量濃度范圍內，線性良好，相關系數均大于0.981，按信噪比S/N=3計算，檢出限分別為：0.020、0.026、0.032 mg/mL。按信噪比S/N=10計算，定量限分別為：0.067、0.087、0.106 mg/mL。

GC-MS與GC-FID均可實現對DAGs異構體的定量分析，均可滿足實驗要求。GC-MS方法的檢出限和定量限更低，略優于GC-FID。但本研究考慮到GC-FID可以大幅降低實驗儀器成本，使實驗方法更加具有實際操作性和可行性，便于大批量樣品的檢測，因此選擇利用FID進行后續的定量分析。

表2 GC-MS與GC-FID對DAGs標品的測定結果對比表Table 2 Determination result table of DAGs between GC-MS and GC-FID

2.3.2 GC-MS與GC-FID測定結果對比分析

采用GC-MS與GC-FID分別對5個初榨橄欖油樣品中1,3-油酸二酯含量進行分析對比(見表3)，兩組數據經過T檢驗，P<0.05，數據之間無顯著性差異，兩者均可用于初榨橄欖油中DAGs異構體的精確定量分析。

表3 初榨橄欖油樣品中1,3-油酸二酯GC-FID與 GC-MS測定結果對比Table 3 Determination result of 1,3-DAG in olive oil samples by GC-MS and GC-FID

2.3.3 精密度分析

選取同一新鮮初榨橄欖油樣品，依照方法處理后，GC-FID進樣。在1 d內連續重復測量5次，計算日內精密度；連續5 d重復測定，每次測3次取平均值，計算日間精密度，結果見表4。由表4可知，該方法的日內精密度和日間精密度分別在1.35%～1.89%與2.33%～4.62%，并且對1,3-油酸二酯進行定量分析，得到其1,3-油酸二酯日內與日間平均值均為0.27 mg/mL(即2.7 mg/g)，RSD值分別為0.02%和0.04%。表明該方法測定橄欖油中DAGs異構體含量精密度較好。

表4 方法日內和日間精密度Table 4 The RSD for the inter- and intra-day

2.3.4 穩定性實驗

同時取6份同種新鮮初榨橄欖油樣品，依照方法處理后，GC-FID進樣，其出峰面積及RSD值見表5。可以看出，各種特征甘油二酯的峰面積RSD值在2.62%～5.71%，并且對1,3-油酸二酯進行定量分析，得到其1,3-油酸二酯平均值為0.24 mg/mL(即2.4 mg/g)， RSD值為0.05%，前處理方法的穩定性較好。

表5 6份同種橄欖油樣品的特征甘油二酯衍生物GC峰面積Table 5 GC peak area of characteristic DAGs in 6 same olive oil samples

2.3.5 回收率實驗

取已經測定1,3-油酸二酯含量的新鮮初榨橄欖油樣品3份，分別加入0.1、0.5 和0.9 mg/mL的1,2-與1,3- 棕櫚酸二酯混標以及1,3-油酸二酯單標標準樣品各1 mL，依照方法處理后，GC-FID進樣。在表6中可以看出各甘油二酯的平均回收率在73.9%～76.9%。

表6 回收率實驗Table 6 Recovery experiment

注：N/D即未檢測到。

2.3.6 橄欖油樣品應用初探

從意大利獲得6種特級初榨橄欖油和4種精煉橄欖油。用1.3的方法進行前處理后，GC-FID進樣并分析橄欖油中2種特征DAGs異構體的含量。如圖4所示，新鮮初榨橄欖油中1,2-DAGs含量明顯均高于1,3-DAGs，精煉橄欖油中1,2-DAGs含量明顯均低于1,3-DAGs。

c-1,2-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰； d-1,3-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰；e-1,2-油酸二酯樣品衍生物峰；f-1,3-油酸二酯樣品衍生物峰圖4 不同橄欖油樣品的DAGs異構體衍生物GC-FID圖Fig.4 GC-FID of DAGs isomers in different olive oil samples

分析2種特征DAGs異構體的峰面積可知，新鮮初榨橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在0.41～0.61， 而精煉橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在2.04～2.39，這符合文獻[8]中對油脂1,3-DAGs與1,2-DAGs穩定比例在6∶4～7∶3之間的描述，并且1,3-油酸二酯平均值為0.26 mg/mL(即2.6 mg/g)，RSD值為0.12%，符合文獻中[19]真實初榨橄欖油中1,3-油酸二酯的含量范圍，可以確定樣品的真實性及結果的可靠性。如圖5所示。

d/c-1,3-油酸棕櫚酸二酯與1,2-油酸棕櫚酸二酯比率；f/e-1,3-油酸二酯與1,2-油酸二酯比率圖5 橄欖油真實樣品中的1,3-DAGs/1,2-DAGs值分布圖Fig.5 The distribution of 1,3-DAGs /1,2-DAGs in olive oil authentic samples (d/c)1,3-palmitoyl-oldipalmitin/1,2-palmitoyl-oldipalmitin (f/e)1,3-diolein/1,2-diolein

將橄欖油中2種主要的特征DAGs異構體的1,3-DAGs/1,2-DAGs結合來看，不同品質的橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率差異明顯，并且甘油二酯異構體比率的大小與橄欖油的新鮮程度呈正相關，由此可以作為區分壓榨橄欖油及精煉橄欖油的鑒別參考。

3 討論

本研究討論了橄欖油經固相萃取后用甲基硅烷化試劑衍生，產生 1,2-DAGs與1,3-DAGs異構體甲基硅烷化衍生物，用GC-FID法定量分析。通過試驗得出最佳衍生條件為:衍生溫度30 ℃，衍生時間1 h。應用外標法定量，1,3-油酸二酯最低檢出限(S/N=3)為0.032 mg/mL，RSD值在1.35%～4.62%，各特征甘油二酯的平均回收率在73.9%～76.9%。利用本試驗方法，測出來自意大利的真實初榨橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在0.41～0.61，精煉橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在2.04～2.39。 實現了利用GC-FID法對橄欖油中DAGs異構體的定量分析，通過1,3-DAGs/1,2-DAGs的值來分析橄欖油品質，并精確定量了6種初榨橄欖油中1,3-油酸二酯的含量，建立了對橄欖油中特定甘油二酯異構體的定量分析方法。后續待進一步檢測大量真實樣品與市售樣品驗證方法的準確性與實用性。本研究的檢測方法對鑒別初榨橄欖油新鮮程度及真偽性具有一定的參考意義，并且可以嘗試應用到其他油類的品質鑒定中。