甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)野生乳酸菌篩選及釀酒特性研究

浩楠，馬騰臻，贠建民，楊學(xué)山，李愛霞，陳彥雄，韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 高臺(tái)，734304)

對(duì)乳酸菌的篩選方向主要以MLF的高耐受性、高抗氧化活性、產(chǎn)香能力[5-8]等方面為主。目前，已確定可進(jìn)行蘋乳發(fā)酵的乳酸菌分別為酒球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)[9-10]。在推廣應(yīng)用方面，酒類酒球菌(Oenococcusoeni)因其快速啟動(dòng)蘋乳發(fā)酵、耐受性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)在葡萄酒發(fā)酵中得到廣泛使用[11-13]。然而，我國(guó)目前所用的主導(dǎo)MLF的乳酸菌主要是國(guó)外商品菌株，國(guó)內(nèi)本土菌株使用較少，造成不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒品質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重，不利于國(guó)產(chǎn)葡萄酒的發(fā)展[14-15]，因此加強(qiáng)本土乳酸菌資源的開發(fā)與利用，篩選出適合我國(guó)不同地域葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)良乳酸菌菌株具有重要意義。

甘肅河西走廊是我國(guó)釀酒葡萄的主要種植區(qū)之一，蘊(yùn)藏著豐富的野生乳酸菌資源，有待科研和釀酒工作者的開發(fā)使用。本實(shí)驗(yàn)采用改良MRS分離培養(yǎng)基從甘肅祁連葡萄酒有限責(zé)任公司處于自然蘋乳發(fā)酵的干紅葡萄酒中分離得到乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，并研究其在葡萄酒環(huán)境下對(duì)pH值、SO2質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和發(fā)酵溫度的耐受性，以期得到釀酒性狀優(yōu)良的乳酸菌，為提升河西走廊產(chǎn)區(qū)葡萄酒品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用葡萄酒樣采樣于2016年10月甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司，釀造實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室酒精發(fā)酵結(jié)束的葡萄酒(殘?zhí)?.02 g/L；pH 3.44；總酸7.07 g/L)。

1.1.2 藥品與試劑

商品乳酸菌2株：OMEGA和VP41，法國(guó)Lallemand公司；放線菌酮：美國(guó)Sigma公司；L-蘋果酸、L-乳 酸含量測(cè)定試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、結(jié)晶紫等其他試劑均為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酚酞指示劑、NaOH標(biāo)準(zhǔn)液等均按GB/T 603—2002《化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》進(jìn)行配制；革蘭氏染色劑等按GB 478935—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行配制。

1.1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；YXQ-LS-5011立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；827型pH，計(jì)上海雷磁公司；Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；CP 214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；1810D超純水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；S·SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、S·HH·W21·600S水浴鍋、GZX-GF101-Ⅱ恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與乳酸菌分離純化

基礎(chǔ)液體改良MRS培養(yǎng)基[16](g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，牛肉膏10，葡萄糖20，無水醋酸鈉3，檸檬酸銨2，吐溫-80 1，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05， 鹽酸半胱氨酸0.5；番茄汁的體積分?jǐn)?shù)20%；用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 6.2～6.4，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入20瓊脂。分離培養(yǎng)基：基礎(chǔ)液體MRS培養(yǎng)基加50 mg/L放線菌酮。

模擬葡萄酒的配制[17](g/L)：蘋果酸3.0，酒石酸3.0，檸檬酸0.5，無水葡萄糖4.0，NaCl 0.2，(NH4)2SO41.0，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO40.05，酵母浸粉4；用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)模擬酒pH至3.4，蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。SO2(以偏重亞硫酸鉀計(jì))20 mg/L， 乙醇的體積分?jǐn)?shù)為10%，滅菌后加入。

乳酸菌的分離純化：采用梯度稀釋平板法[16]，將葡萄酒樣按梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋后，吸取0.1 mL涂于分離培養(yǎng)基上對(duì)菌株進(jìn)行分離，27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，挑取分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為乳白色、光滑、菌落直徑小于1 mm的單菌落反復(fù)進(jìn)行劃線分離直至純化。

1.2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：用快速壓片法對(duì)初篩菌株進(jìn)行制片，光學(xué)顯微鏡下油鏡鏡檢[18]。

革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)按照以下步驟進(jìn)行：

涂菌→干燥→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢

過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：取一環(huán)純化后的培養(yǎng)菌，涂于干凈的載玻片上，然后在其上滴加3%(體積分?jǐn)?shù))的H2O2，于半分鐘內(nèi)有氣泡則為陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)[19]。

生理生化鑒定：根據(jù)文獻(xiàn)及Bergey’S細(xì)菌鑒定手冊(cè)[19-20]對(duì)乳酸菌生理生化特征的描述標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合其釀酒適應(yīng)性對(duì)初篩菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 蘋果酸分解能力及降酸能力測(cè)定

蘋果酸分解能力：在無菌條件下，將初篩菌株接入含有L-蘋果酸(3 g/L)的MRS液體培養(yǎng)基中，每隔24 h進(jìn)行1次紙層析監(jiān)測(cè)，并觀察蘋果酸斑點(diǎn)的變化，蘋果酸斑點(diǎn)消失即為蘋果酸分解完畢[21]。

降酸能力測(cè)定：將供試菌株以107CFU/mL接種至模擬酒中，20 ℃條件下培養(yǎng)，采用酸堿滴定法[22]，在發(fā)酵過程中每隔24 h取樣2 mL，加入50 mL蒸餾水，2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)并計(jì)算，結(jié)果以酒石酸計(jì)(g/L)。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

初篩菌株的分子生物學(xué)鑒定采用16S rDNA分析的方法，由上海生工生物工程有限公司對(duì)菌株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過DNA STAR完成序列處理，將處理好的乳酸菌的16S rDNA及基因序列提交到NCBI/Gen Bank，用BLAST程序與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的乳酸菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析。

1.3 菌株釀酒適應(yīng)性篩選

對(duì)pH值、SO2、乙醇濃度適應(yīng)性篩選：分別將供試菌株與商品酒類酒球菌OMGEA與VP41以107CFU/mL 的接種量接種至不同pH值(3.0、3.2、3.4、 3.6、3.8)，不同SO2質(zhì)量濃度(10、30、50、70、90 mg/L)， 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(8%、10%、12%、14%、16%)的模擬葡萄酒(121 ℃滅菌20 min)中，20 ℃ 靜置培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況并用分光光度法對(duì)菌密度OD600進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)發(fā)酵溫度適應(yīng)性篩選：將供試菌株與商品酒類酒球菌OMGEA與VP41以107CFU/mL的接種量接種至模擬葡萄酒中以不同發(fā)酵溫度(12、15、18、21、25 ℃) 靜置培養(yǎng)并對(duì)菌密度OD600進(jìn)行測(cè)定。

1.4 菌株釀造實(shí)驗(yàn)

將供試菌株與商品酒類酒球菌OMGEA與VP41以107CFU/mL的接種量接種至酒精發(fā)酵結(jié)束的葡萄酒中進(jìn)行蘋乳發(fā)酵，發(fā)酵溫度20 ℃，采用紙層析法進(jìn)行過程監(jiān)測(cè)，發(fā)酵結(jié)束后采用酶試劑盒測(cè)定葡萄酒中L-蘋果酸和L-乳酸的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

通過稀釋涂布平板分離法和平板劃線分離法，在MRS分離培養(yǎng)基上分離純化得到24株菌株，對(duì)篩選菌株進(jìn)行了編號(hào)(見表1)。

表1 分離菌株一覽表Table 1 Isolated strains

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

27 ℃條件下培養(yǎng)5 d，菌株在固體培養(yǎng)基表面形成直徑小于1 mm的光滑乳白色菌落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，也存在大于1 mm的情況。分離菌株在MRS固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，符合文獻(xiàn)[23]對(duì)乳酸菌的描述。通過革蘭氏染色和顯微鏡對(duì)菌株進(jìn)行鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株細(xì)胞革蘭氏染色均為陽性，且細(xì)胞均呈橢圓或球形、成對(duì)排列。符合《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]中對(duì)細(xì)菌形態(tài)學(xué)的描述標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

初步篩選的菌株(表1)經(jīng)過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，得到如下結(jié)果(表2)。所篩選的24株菌株中有14株菌株為陰性，符合對(duì)乳酸菌過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)的描述[19]。

表2 菌株過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)Table 2 Catalase experiment of Isolates strains

注：+：陽性，-：陰性；菌株及編號(hào)參照表1。

2.2.3 生理生化鑒定

對(duì)上述14株初篩菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)(表3)，結(jié)果表明菌株符合《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]對(duì)乳酸菌屬生理生化特征的描述標(biāo)準(zhǔn)。其中編號(hào)4，14，17，18的菌株符合對(duì)短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的特征描述，編號(hào)9，22的菌株符合對(duì)Lactobacilluskunkeei的特征描述。編號(hào)3，6，7，12，15，19，21，24的菌株符合對(duì)小片球菌(Pediococcusparvulus)的特征描述。

表3 初篩菌株糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table 3 Sugar fermentation experiment of preliminary screening strains

注：+：陽性，-：陰性；菌株及編號(hào)參照表1。

2.3 蘋果酸分解能力及降酸能力測(cè)定

2.3.1 蘋果酸分解實(shí)驗(yàn)

乳酸菌的蘋果酸分解能力是評(píng)估其降酸能力的主要指標(biāo)。將上述菌株的蘋果酸分解能力由紙層析進(jìn)行初步確定。由圖1可以看出，編號(hào)為3，7，12，15，19的5株菌株具有較好的蘋果酸分解能力，分別在發(fā)酵的72，72，84，96，84 h蘋果酸斑點(diǎn)消失。編號(hào)為6，21，24的菌株分解蘋果酸能力較差，基本不具備蘋果酸分解能力。而編號(hào)為4，9，14，17，18，22的菌株完全不具有蘋果酸分解能力(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 初篩菌株蘋果酸分解實(shí)驗(yàn)Fig.1 Malic acid decomposition test of primary screening strains注：M：L-蘋果酸標(biāo)品； L：L-乳酸標(biāo)品；菌株及編號(hào)參照表1。

2.3.2 降酸能力實(shí)驗(yàn)

將上述具有蘋果酸分解能力的5株菌株進(jìn)行降酸能力測(cè)定，結(jié)果見圖2。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液中的總酸含量逐漸減少。在發(fā)酵的第1～2天菌株處于適應(yīng)期，對(duì)發(fā)酵液中的酸分解緩慢，但在發(fā)酵的第3～6天各菌株發(fā)酵液中的總酸含量下降最快(按酒石酸計(jì))。與商業(yè)菌株OMEGA和VP41對(duì)比，篩選得到的菌株都具有較好的降酸能力。其中，C302-3、C321-3菌株在發(fā)酵的初期降酸緩慢，但隨著菌株對(duì)發(fā)酵液環(huán)境的適應(yīng)最終能與商業(yè)菌株的降酸能力差異不顯著。而C171-1、C301-1、F461-1菌株的整個(gè)降酸過程的趨勢(shì)與商品菌株相似。

圖2 初篩菌株的降酸能力Fig.2 The ability of primary screening strains to degrade acid

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株C171-1、C301-1、C302-3、C321-3、F461-1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.4.1 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

電泳檢測(cè)5株菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖3可知，5個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500～2 000 bp有1條擴(kuò)增帶。

圖3 初篩菌株的PCR電泳圖Fig.3 The PCR electrophoretogram of screened strains注：MK-Marker，A-C171-3、B-C301-1、C-C302-3、D-C321-3、E-F461-1。

2.4.2 16S rDNA測(cè)序比對(duì)

將5個(gè)初篩菌株的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果在Gen Bank用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4，比對(duì)結(jié)果如下：C171-3與C321-3為PediococcusparvulusNi555(登錄號(hào)：AB601176.1)；C301-1與C302-3為PediococcusparvulusMA55(登錄號(hào)：KY425789.1)；F461-1為Pediococcusparvulusgp116(登錄號(hào)：KM495950.1)。最終得知這3株菌株均為乳酸菌屬的小片球菌(Pediococcusparvulus)。

圖4 初篩菌株的基因系統(tǒng)進(jìn)化樹圖譜Fig.4 Phylogenetic tree establishment of lactic acid bacteria from 5 species

2.5 菌株釀酒適應(yīng)性分析

將上述鑒定的3株菌株(簡(jiǎn)化為C30、C17、F46)進(jìn)行釀酒適應(yīng)性測(cè)定，通過對(duì)pH值、SO2質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵溫度這4個(gè)釀造條件的耐受性進(jìn)行分析。

2.5.1 pH

pH值是影響乳酸菌生長(zhǎng)的重要因素。從圖5可以看出，pH值對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響十分顯著。隨著pH的升高，菌株的OD600值呈上升趨勢(shì)，即菌株的生長(zhǎng)能力隨著pH的升高而增強(qiáng)。干紅葡萄酒的pH值多為3.4～3.6[15]，pH為3.4時(shí)，與商品菌株OMEGA及VP41比較，菌株C30的OD600值與商品菌株差異不顯著(P>0.05)且表現(xiàn)出良好的耐受性。盡管菌株F46和C17生長(zhǎng)能力較商品菌株弱，但也能啟動(dòng)蘋乳發(fā)酵。

圖5 菌株的pH耐受能力Fig.5 The ability of the strain to tolerate pH

2.5.2 SO2質(zhì)量濃度

加入適量的SO2對(duì)葡萄酒中的有害微生物具有抑制作用，同時(shí)可達(dá)到抗氧化等作用[21]。因此，需對(duì)菌株進(jìn)行SO2的耐受性考察。從圖6可以看出，隨著SO2濃度的增加，菌株的OD600值呈下降趨勢(shì)，即菌株的生長(zhǎng)能力隨著SO2濃度的增加而降低。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，與商品菌株比較，菌株C30與F46表現(xiàn)出強(qiáng)于商品菌株的SO2耐受性，表明篩選的C30與F46菌株在一般葡萄酒含有的SO2濃度下具有較強(qiáng)的耐受性。然而當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為90 mg/L時(shí)，所有菌株均已不能生長(zhǎng)。

圖6 菌株的SO2耐受能力Fig.6 The ability of the strain to tolerate SO2

2.5.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)也是抑制乳酸菌生長(zhǎng)的主要因素，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)就會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)[17]。從圖7可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株的OD600值呈下降趨勢(shì)，即菌株的生長(zhǎng)能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，篩選的3株菌株表現(xiàn)出較商品乳酸菌更好的耐受性。一般葡萄酒的酒精度在12%～14%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，菌株C30的OD600值為0.23，與商品菌株差異顯著(P<0.05)，但在乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí)，5株菌株的生長(zhǎng)均受到強(qiáng)烈抑制。

圖7 菌株的乙醇耐受能力Fig.7 The ability of the strain to tolerate alcohol

2.5.4 發(fā)酵溫度

干紅葡萄酒的蘋乳發(fā)酵溫度為18～20 ℃[17]。此次篩選出的菌株來自于河西走廊地區(qū)，該地區(qū)屬于冷涼的地區(qū)，由于該地區(qū)在蘋乳發(fā)酵時(shí)發(fā)酵溫度較低，因此菌株需對(duì)發(fā)酵溫度具有一定的耐受性[24]。從圖8可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株的OD600值呈上升趨勢(shì)，即菌株的生長(zhǎng)能力隨著發(fā)酵溫度的升高而增強(qiáng)。圖中篩選的3株菌株在不同的發(fā)酵溫度條件下的生長(zhǎng)能力較2株商品菌株強(qiáng)。但當(dāng)發(fā)酵溫度為15 ℃時(shí)，篩選的3株菌株與商品菌株差異顯著(P<0.05)，表明其在較低溫度條件下也有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。

圖8 菌株的發(fā)酵溫度耐受能力Fig.8 The ability of the strain to tolerate the temperature of the fermentation

2.6 菌株釀造實(shí)驗(yàn)

在經(jīng)供試菌株與商品酒類酒球菌OMGEA與VP41發(fā)酵的葡萄酒中，L-蘋果酸和L-乳酸的含量見表4。數(shù)據(jù)顯示，酒樣中的L-蘋果酸被菌株消耗轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸，與商品菌株OMEGA和VP41發(fā)酵酒樣比較，菌株C30、C17、F46發(fā)酵酒樣中L-蘋果酸和L-乳酸含量差異不顯著，表明篩選的菌株具有較好的分解L-蘋果酸的能力。

表4 葡萄酒中L-蘋果酸和L-乳酸的含量Table 4 The content of L-malic acid and L-lactic acid in wine

注：表中同一指標(biāo)內(nèi)不同字母代表差異顯著，樣本量n=3，P<0.05。

本試驗(yàn)篩選的菌株均為小片球菌(P.parvulus)，而最終分離的菌株當(dāng)中沒有酒類酒球菌，這可能與其生長(zhǎng)力較弱有關(guān)[14]。在液體培養(yǎng)基中，由于沒有乙醇等的抑制，生長(zhǎng)能力強(qiáng)的乳桿菌、片球菌等乳酸菌爭(zhēng)奪了培養(yǎng)基中的大部分營(yíng)養(yǎng)，使酒類酒球菌等長(zhǎng)勢(shì)較弱的菌株無法生長(zhǎng)，分離的菌種受到限制[20]。在葡萄酒中分離到的片球菌中，有害片球菌(P.damnosus)和小片球菌(P.parvulus)較常見。研究表明，片球菌可能會(huì)產(chǎn)生一些發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)[11,18]，增加發(fā)酵食品風(fēng)味的復(fù)雜性，但也有研究表明片球菌通過利用發(fā)酵飲料中的殘留糖而引起酒體黏稠、影響葡萄酒過濾，從而降低葡萄酒質(zhì)量[25-26]。本試驗(yàn)中，自然蘋乳發(fā)酵后的酒樣并未觀察到黏稠現(xiàn)象，這可能是由于模擬酒糖含量低(4 g/L)，片球菌主要以蘋果酸為碳源，故無多糖產(chǎn)生所致。然而，以單一片球菌株進(jìn)行蘋乳發(fā)酵對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響還需進(jìn)一步研究。所以，將葡萄酒中的小片球菌進(jìn)行釀造分析對(duì)葡萄酒發(fā)酵及其品質(zhì)具有重要意義。

3 結(jié)論

采用MRS分離培養(yǎng)基從甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司干紅葡萄酒中分離獲得24株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定、蘋果酸分解實(shí)驗(yàn)等，得到其中5株具有較好的降酸能力。

經(jīng)16S rDNA分析得到3株菌株均為小片球菌(Pediococcusparvulus)。分別為PediococcusparvulusNi555(登錄號(hào)：AB601176.1)；PediococcusparvulusMA 55(登錄號(hào)：KY425789.1)；Pediococcusparvulusgp116(登錄號(hào)：KM495950.1)。

與商品乳酸菌比較，3株小片球菌均表現(xiàn)出較好的釀酒適應(yīng)性，其中菌株C30對(duì)低發(fā)酵溫度(15 ℃)、高SO2質(zhì)量濃度(50 mg/L)和高乙醇體積分?jǐn)?shù)(14%)耐受性較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵適應(yīng)性。