靜電紡絲法制備玉米醇溶蛋白基納米纖維抗菌膜

李娟，許雪兒，胡衛成，余培斌，魯振杰，陳正行*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室(淮陰師范學院)，江蘇 淮安，223300) 3(江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

靜電紡絲法制備納米纖維膜具有較強透氣性、較大比表面積、孔隙率及柔韌性[1]。傳統的靜電紡絲多使用環糊精、尼龍、聚氧環乙烯等作為紡絲液原料，但因其對環境污染較大、不可食用性、和毒性等限制其應用。而玉米醇溶蛋白(zein)作為食源性原材料，其成膜性，無毒無害性和良好的生物相容性被廣泛應用于生物膜材料的制備。WANG等制備zein基納米纖維膜作為藥物控釋體系，包裹姜黃素等藥物為研究其緩釋溶出機理提供理論依據[2]；劉永佳等將zein與羥基磷灰石共紡制備得到的納米纖維膜，可作為細胞生長載體以培養骨髓間充質干細胞，并有效提高細胞存活率[3]。本實驗中研究制備的納米纖維抗菌膜采用了玉米醇溶蛋白和阿拉伯膠2種生物大分子進行構建，鑒于玉米醇溶蛋白和阿拉伯膠良好的生物相容性和安全性，因此比較適合用于食品以及醫藥等對安全性要求較高的領域。

百里香酚作為天然抗菌劑可有效抑制微生物的繁殖，但因其疏水性強、具有刺激性氣味和生物利用率低等缺陷限制了其應用。本研究中將所制備的玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠運載體系負載以百里香酚制備抗菌膜，尤其適用于醫藥領域對革蘭氏陰性菌的抗菌作用。此外，本研究中采用的靜電紡絲技術所制備的納米纖維膜較其他技術所制備的納米纖維膜具有透水透氣性好的優點，因此本實驗制備的納米纖維抗菌膜特別適用于醫藥領域對透氣性要求高的材料，例如：用于制備接觸皮膚的藥物敷料等。因此，本論文以zein為基質負載百里香酚并利用靜電紡絲技術制備得納米纖維抗菌膜，不僅提高了百里香酚等疏水性物質的生物利用率，而且起到一定的緩釋作用，在生物醫藥行業具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米醇溶蛋白(純度91%)，購于河南華瑞生物科技有限公司；阿拉伯膠(GA)和百里香酚，購自美國Sigma試劑公司；無水乙醇等試劑，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

自制靜電紡絲裝置：DW-P203-10AC型高壓數顯電源，天津市東文高壓電源廠；MS-MP8數顯磁力攪拌器，大韓WiseStir公司；SU8220冷場發射掃描電子顯微鏡，日本日立株式會社；OCA15EC視頻光學接觸角測量儀，德國徠卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白與阿拉伯膠納米顆粒的結構測定

zein-GA納米顆粒的制備方法見許雪兒等研究[4]。

1.3.1.1 熒光光譜分析

取1 mL新鮮制備的質量濃度為1 g/L的zein-GA納米顆粒(zein初始儲備液質量濃度為50 g/L、m(zein)∶m(GA) =1∶1.5)于離心管中，并使用10 mmol /L的pH=4.0的緩沖液稀釋至100倍。按照不同比例分別加入NaCl制備得到含1、2、5 mmol/L NaCl的zein-GA納米顆粒；按照不同比例分別加入十二烷硫酸鈉(SDS)制備得到SDS質量濃度為2.5、5.0、 10.0 g/L的zein-GA納米顆粒。將制備好的不同NaCl濃度影響的zein-GA納米顆粒和不同SDS濃度影響的zein-GA納米顆粒，在發射光譜為400～600 nm，激發波長為370 nm、發射波長為490 nm的條件下，檢測不同zein-GA納米顆粒的熒光強度[5]。其中橫坐標為發射光譜波長，縱坐標為熒光強度。

1.3.1.2 傅立葉變換紅外光譜(FTIR)

取100 mL新鮮制備的zein-GA納米顆粒m(zein)∶m(GA)=1∶1.5)于45 ℃下旋轉蒸發以除去乙醇，然后4 000 r/min離心10 min以除去大分子，所得樣品冷凍干燥72 h得zein-GA納米顆粒固體粉末。稱取0.2 g zein、0.2 g GA和0.2 g zein-GA納米顆粒固體粉末分別與純溴化鉀以1∶100充分研磨混合。最后，將混合粉末用壓片機壓制成圓形片狀并置于載物臺上以測定結構。其中，以純溴化鉀片為基線，設定掃描范圍為550～4 000 cm-1對樣品進行掃描[6]。所得紅外圖像采用OMNIC 8.2軟件進行分析。

1.3.2 靜電紡絲法制備抗菌膜

利用靜電紡絲機制備zein-百里香酚復合納米纖維膜。首先，稱取0.5 g zein溶解于冰乙酸中，并按照不同zein與百里香酚質量比為1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、50∶1、 100∶1稱取百里香酚溶解到zein的冰乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌120 min后得到紡絲液。其中設定空白對照為不添加百里香酚的zein紡絲液。其次，將錫箔紙均勻覆蓋在垂直放置于針筒的接收滾筒上，應避免出現褶皺導致膜的完整性受到影響。電極兩端分別連接注射針頭和接收滾筒，注射器針頭水平放置并垂直于接收滾筒的中央，噴頭處距離接收滾筒距離為15 cm。設定紡絲電壓為15.23 kV，控制溫度為25 ℃，空氣濕度為50%。紡絲過程中將柜門關閉，以確保空氣濕度和溫度不受外界影響。紡絲結束后，取下錫箔紙，將所得納米纖維膜置于干燥器內常溫避光保存[3]。

1.3.3 抗菌膜性質的測定

1.3.3.1 抗菌膜電子掃描顯微鏡觀察

將抗菌膜剪成1 cm×1 cm大小的膜片并放置于導電膠上固定后噴金，采用電子束對樣品進行微觀形貌拍攝，設定電壓為30 kV，電流為50 pA，電子束加速電壓為5 kV，鏡頭放大倍數為5 000倍。

1.3.3.2 抗菌膜中百里香酚釋放率測定

稱取負載不同zein與百里香酚質量比的zein-百里香酚靜電紡納米纖維膜各10 mg，將zein-百里香酚納米纖維膜放入透析袋中，加入50 mL去離子水，用夾子將透析袋兩端夾緊并浸入足夠的透析介質中，使得透析袋內外有足夠的液體進行介質交換。設定燒杯內轉子轉速設為100 r /min，每隔一定時間移取適量體積的釋放液加入2 mL乙酸乙酯進行渦旋，并用分光光度計在276 nm下測定吸光值，帶入標準曲線計算釋放百里香酚濃度，按照公式(1)計算釋放率[7]。

(1)

1.3.3.3 抗菌膜表面接觸角測定

將抗菌膜剪成1 cm×1 cm大小的膜片并置于載物臺上，調節注射器針頭使得針頭垂直于膜片并且距離膜片中心1 cm的位置，用注射器吸入一定量的去離子水并由電動注射控制單元推出水滴，用視頻攝像系統在15 s內每隔一定時間連續采集液滴的外形并及時保存圖片，用自帶的接觸角測量系統分析測定接觸角大小，每張膜片平行測定3次，每張抗菌膜剪取3張膜片，去除誤差較大值后計算平均值定為該膜片的接觸角。

1.3.3.4 抗菌膜透氣性(WVP)的測定

首先，將足量固體CaCl2置于105 ℃烘箱烘干至恒重后，將其放入稱量瓶中。分別將zein-百里香酚復合納米纖維膜和醫用創可貼繃緊并盡可能的密封于稱量瓶口上。將密封好的稱量瓶置于干燥器中，干燥器下方放置飽和BaCl2溶液以確保干燥器內相對濕度90%。在24 h內每隔一定時間稱取稱量瓶重量，通過固體CaCl2的質量變化和公式(2)來計算納米纖維膜的透氣性[8]。

(2)

式中：C表示水蒸氣通透速率，即氯化鈣質量與時間關系曲線的斜率，g/h；X表示膜厚度，mm；ΔP表示膜兩側水蒸氣壓差，膜兩側相對濕度為90%，25 ℃時水蒸氣飽和蒸汽壓為3.17 kPa，則ΔP=3.17×90%=2.85 kPa；A表示膜的有效面積，m2。

1.3.4 抗菌膜抑菌效果測定

將不同百里香酚荷載量的抗菌膜裁剪成直徑為6 mm的圓形膜片并于紫外燈下照射15 min，用鑷子分別移置于接種有大腸桿菌菌液的LB固體培養基上，在37 ℃條件下與大腸桿菌一同恒溫培養24 h，24 h 后觀察抑菌情況并測量抑菌圈直徑[9]。

1.3.5 數據統計與分析

實驗均重復測定3次，并用標準差對數據進行平均數分析。利用SPSS軟件對所得實驗數據進行統計學分析，采用Duncan檢驗法進行顯著性分析。所有圖形均由Origin 9.0進行繪制分析。

2 結果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白與阿拉伯膠納米顆粒的結構表征

2.1.1 熒光光譜分析

為確定zein-GA納米顆粒的相互作用方式，使用8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)結合氨基酸疏水殘基以表現不同條件下zein-GA納米顆粒的熒光強度。隨著GA含量的增加，納米顆粒結合的ANS的熒光強度顯著(P<0.05)降低，而當zein與GA質量比為1∶1.5、1∶2、 1∶2.5、1∶5時，zein-GA納米顆粒的熒光強度有所降低但無顯著變化，其中zein與GA質量比為1∶1.5時，納米顆粒熒光強度變化最大。ANS與zein納米顆粒中的疏水殘基的結合顯示此時ANS的熒光強度最高，而GA的增加進一步減小其熒光強度，可能是因為zein納米顆粒表面疏水基團的變化影響了ANS的結合能力，同時zein表面的疏水區域被阻斷進而體現為熒光強度降低[10]。

當zein與GA質量比為1∶1.5 時，隨著納米顆粒體系中NaCl和SDS濃度的增加，zein-GA納米顆粒熒光強度均顯著增加(P<0.05)。 可能是由于NaCl破壞了帶負電的GA和帶正電的zein氨基酸殘基間的靜電相互作用力，導致zein的疏水性殘基和ANS之間的結合使得熒光強度增大，即NaCl阻斷了zein和GA的結合位點。增大的SDS濃度對zein-GA納米顆粒的熒光強度的影響是因為當SDS濃度增大時破壞了zein和GA的疏水作用力即破壞zein和GA的作用位點導致熒光強度增大[5]。綜上所述，zein-GA納米顆粒可能是由zein和GA產生靜電相互作用以及疏水相互作用力所形成的。

2.1.2 紅外光譜分析

zein、GA和zein-GA納米顆粒的FTIR光譜如圖1所示。在FTIR光譜圖中，從左往右第1個特征峰在3 200～3 400 cm-1，分別為3 412.8 cm-1、3 303.38 cm-1和3 369.65 cm-1，表明在zein、GA和zein-GA納米顆粒中存在羥基。此外，zein-GA納米顆粒羥基的峰值發生在3 303.38 cm-1(zein)和3 412.81 cm-1(GA)之間，這說明zein中谷氨酰胺的酰胺基團和GA的羥基之間有可能形成氫鍵。第2個特征吸收峰是在1 500～1 700 cm-1的伸縮振動峰。在1 654.28 cm-1、1 535.78 cm-1、1 449.79 cm-1的zein的特征峰分別代表了酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶[11]。而在zein-GA納米顆粒中，這些拉伸振動峰的出峰位置分別為1 653.9 cm-1、1 545.69 cm-1和1 419.79 cm-1。數據表明酰胺Ⅰ和Ⅲ帶的峰值紅移，酰胺Ⅱ的特征峰藍移，可能是分子內部相互作用力的形成改變了酰胺帶環境。DAI等[6]研究zein-卵磷脂復合納米顆粒時表明，在zein納米顆粒中酰胺Ⅱ基團的拉伸振動峰為1 527 cm-1，當形成了zein-卵磷脂納米顆粒時，酰胺Ⅱ基團的拉伸振動峰藍移至1 533 cm-1，表明卵磷脂和zein之間可能存在靜電和疏水相互作用力。綜上所述，在zein和GA之間可能存在靜電相互作用或疏水相互作用促進納米顆粒的形成。第3個特征峰1 616.68 cm-1和1 420.11 cm-1代表的是GA中羧基的不對稱和對稱振動峰[12-13]。然而，位于的特征峰1 616.68 cm-1在zein-GA納米顆粒中未出現，只有1 419.78 cm-1的峰值仍然存在。因此，可能是由于zein和GA的相互作用改變了zein-GA紅外光譜中的結構。

圖1 zein、GA和zein-GA納米顆粒紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of zein, GA and zein-GA nanoparticles

2.2 抗菌膜微觀結構分析

如圖2所示為不同百里香酚負載量的zein靜電紡納米纖維抗菌膜微觀結構形貌圖。所有微觀結構圖片都是納米纖維無規則堆砌成孔隙率較高的膜。其中，圖2-a、圖2-b分別為zein與百里香酚質量比為1∶1、2∶1時的納米纖維膜，可以看出高負載量的紡絲液可紡性較差，當百里香酚負載量較高時，部分納米纖維直徑變粗、粘連和斷絲現象，并且出現少量百里香酚結晶引起的串珠現象，這可能是由于百里香酚的加入使得紡絲液黏度增大，電導率升高進而使得靜電紡絲射流在噴嘴處阻塞，出現射流方向不穩定、不連續等問題[14]。

a-m(zein)∶m(百里香酚)=1∶1；b-m(zein)∶m(百里香酚)=2∶1；c-m(zein)∶m(百里香酚)=5∶1；d-m(zein)∶m(百里香酚)=10∶1；e-m(zein)∶m(百里香酚)=50∶1；f-m(zein)∶m(百里香酚)=100∶1圖2 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜微觀形貌影響Fig.2 Effects of the different mass ratios of zein∶thymol on the micromorphology of zein-thymol nanofiber films

由圖2-c、圖2-d、圖2-e、圖2-f中可得，百里香酚負載量逐漸減小時，靜電紡絲納米纖維形貌為均勻的圓柱體，纖維表面光滑，沒有串珠和斷絲現象。此外，纖維直徑均為納米級，平均直徑在200～300 nm，表明在一定的百里香酚負載量內，zein和百里香酚能夠較好的共混溶解和分散于紡絲液中，且百里香酚可以被包裹于zein靜電紡纖維中。

2.3 抗菌膜中百里香酚釋放率

如圖3所示，當釋放時間達到12 h時，zein與百里香酚質量比為100∶1的納米纖維抗菌膜的釋放率為78.57%， 且不同zein與百里香酚質量比下所得抗菌膜的釋放速率隨著百里香酚含量的增大而增大至95.24%。這可能是由于納米纖維較大的比面積使得纖維膜與藥物接觸的面積增大，當百里香酚負載量過高時，藥物不能夠完全包裹，游離部分發生突釋；當百里香酚負載量較低時，藥物被包裹于纖維內部需緩慢釋放至完全[7]。此外，納米纖維抗菌膜中百里香酚釋放率均隨著時間的推進而趨于穩定。其中，在前1 h 內即百里香酚釋放初期不同zein與百里香酚質量比的抗菌膜均存在突釋效應，這可能是因為部分存在于納米纖維表面的百里香酚通過擴散作用立刻釋放出來，且隨著百里香酚比例的增大，初期的突釋效應變得更加明顯，推測是由于未被包裹的藥物擴散效應較強，此時藥物擴散速率大于溶出速率[15]。在后期的釋放過程中，所有納米纖維膜都呈現緩釋效應，包裹于纖維內部的百里香酚逐漸從纖維中釋放出來，釋放速率逐漸減小，但釋放介質中百里香酚濃度逐漸升高，一定程度上抑制了擴散作用[16]。

圖3 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜中百里香酚釋放率影響Fig.3 Effects of the different mass ratios of zein∶thymol on the release rates of thymol from zein-thymol nanofiber films

2.4 抗菌膜表面接觸角分析

如圖4所示，不同zein與百里香酚質量比下所得抗菌膜表面接觸角隨著百里香酚占比的增大而逐漸增大。表面接觸角能體現納米纖維抗菌膜的潤濕性，單獨的zein纖維膜表面接觸角為93.81°，呈現疏水性，這與zein本身含75%的疏水氨基酸及zein不溶于水的性質相符合[17]。隨著百里香酚含量的提高，靜電紡抗菌膜纖維直徑變粗，且存在藥物結晶現象，這使得納米纖維橫縱分布形成的纖維孔隙變小，因此抗菌膜的疏水作用變強，表面接觸角逐漸增大至112.21°，對水的阻隔性變大，同時百里香酚為疏水性物質也使得體系接觸角向疏水性轉變[18]。因此，負載百里香酚的zein納米纖維抗菌膜水穩定性隨著時間的增大而提高。

圖4 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜表面接觸角的影響Fig.4 Effects of the different mass ratios of zein:thymol on contact angles of zein-thymol nanofiber films

由表1可以看出，不同zein與百里香酚質量比下所得抗菌膜在15.43 s內能夠被水完全浸濕。同時，百里香酚比例含量越大，浸濕所需時間越長，有利于其在醫用傷口敷料中具備一定防水性。因此在制備抗菌膜時，考慮在不改變納米纖維性質的同時盡可能提高藥物負載量，以降低成本，達到提高藥效和防水性作用。

表1 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜完全潤濕的影響Table 1 Effects of the different mass ratios of zein∶thymol on the complete wetting time of zein-thymol nanofiber films

注：不同字母a、b、c代表差異顯著(P<0.05)。

2.5 抗菌膜水汽透過率分析

不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜的水汽透過率影響如表2所示，負載百里香酚的zein納米纖維抗菌膜的水汽透過率顯著(P<0.05)高于創可貼的水汽透過率。負載百里香酚的zein均勻紡成絲，錯綜交叉形成層層纖維膜，改變水汽遷移途徑為曲折型，影響水分子從膜中的遷移效率[19]。隨著百里香酚負載量的降低，zein-百里香酚納米纖維抗菌膜的透氣性逐漸變好至4.72 g·mm/(m2·h·kPa)，可能是因為當百里香酚負載量較高時納米纖維較為粗壯扁平，不利于水汽的透過，而當負載量減小時，百里香酚被完全包裹于納米纖維膜中，水汽透過率因此提高[20]。該結果與微觀結構圖及接觸角數據相一致，表明負載合適比例的百里香酚的zein納米纖維膜具有較好的醫用前途。李鑫等[21]在制備zein納米纖維膜時也發現，納米纖維膜的水汽透過率與醫用紗布的水汽透過率相差較小，表明其較大的孔隙率促進其水蒸氣的透過率的提高。

表2 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜水汽透過率的影響Table 2 Effects of the different mass ratios of zein∶thymol on the WVP of zein-thymol nanofiber films

注：不同字母a、b、c代表差異顯著(P<0.05)。

2.6 抗菌膜抗菌效果分析

如表3所示，不同zein-百里香酚比的抗菌膜對大腸桿菌菌群形成的抑菌圈直徑也有所不同。其中當zein與百里香酚質量比為1∶1、2∶1、5∶1、10∶1時，zein-百里香酚納米纖維抗菌膜對大腸桿菌有顯著(P<0.05) 抑菌效果，隨著百里香酚含量的減小，抑菌圈直徑從20.42 mm減小至8.68 mm。當zein與百里香酚質量比為50∶1、 100∶1和未負載百里香酚的zein納米纖維膜時，未有抑菌圈出現?？赡苁羌{米纖維膜百里香酚含量較低導致抑菌效果較弱[22]。

表3 不同zein與百里香酚質量比對抑菌圈的影響 表3 Effects of the different mass ratios of zein∶thymol on the diameters of inhibition zone

注：“-”代表未檢出抑菌圈；不同字母a、b、c代表差異顯著(P<0.05)。

結合圖5，zein與百里香酚質量比為1∶1、2∶1、5∶1 時抑菌圈顯著(P<0.05)出現，且膜面及膜圓周都未有大腸桿菌形成；當zein與百里香酚質量比為10∶1時，zein-百里香酚納米纖維抗菌膜已無抑菌圈出現，且存在較多單個大腸桿菌菌群，表明該比例下zein-百里香酚抗菌膜抑菌能力下降，但膜面未形成大腸桿菌菌落；當zein與百里香酚質量比為100∶1時，zein-百里香酚抗菌膜無抑菌圈出現，且膜面形成大腸桿菌菌群。同時可以發現zein納米纖維膜對于大腸桿菌菌群也未形成抑菌圈，且大腸桿菌長滿整個膜面，外觀結構來看膜的顏色已由原來的黃色變成暗灰色。綜上所述，zein與百里香酚質量比為1∶1、2∶1、5∶1的zein-百里香酚納米纖維抗菌膜有顯著抑菌特性。

圖5 不同zein與百里香酚質量比對抗菌膜抑菌圈的影響Fig.5 Effects of the different mass ratios of zein- thymol on the inhibition zone of zein-thymol nanofiber films

3 結論

通過靜電紡絲法制備得到zein-百里香酚納米纖維膜，其水汽透過率和疏水穩定性良好，安全性和生物兼容性好，在生物醫藥行業具有廣泛的應用前景。此外，可有效實現對諸如百里香酚等疏水性物質的緩釋，提高其生物利用率。