T-2毒素對人腎小管上皮細胞HK-2體外增殖和凋亡的影響

鮮婷婷，韓小敏，韓春卉，李鳳琴，徐文靜，張宏元，屠康

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京 210095) 2(國家食品安全風險評估中心國家衛生健康委員會食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021)

T-2毒素是由三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、擬枝飽鐮刀菌(F.sporotrichioides)、梨孢鐮刀菌(F.poae)和雪腐鐮刀菌(F.nivale)等多種鐮刀菌在特定條件下代謝產生的單端孢霉烯族化合物，具有毒性強、化學性質穩定、熱及酸性條件下不易被破壞的特點[1-4]。T-2毒素廣泛分布于自然界，可污染農作物和儲藏的谷物等，攝入被T-2毒素污染的谷物將嚴重影響動物和人類的健康。研究表明，T-2毒素可對人和動物的多個組織器官包括血液、消化系統、免疫系統等產生毒性效應[5]。本實驗室前期動物實驗表明，T-2毒素對Wistar大鼠腎臟具有明顯損傷作用，T-2毒素灌胃后有尿血癥狀出現，病理切片檢查可見腎小管上皮細胞腫脹(該部分結果尚未發表)。王麗華等[6]也發現低劑量T-2毒素在短時間內可對腎臟造成損害，可引起腎近曲小管上皮細胞嗜酸性變和壞死、細胞核固縮，細胞器減少、基膜明顯增厚和部分線粒體髓樣變等。HK-2細胞是一種永生化的人腎小管上皮細胞，是研究腎毒性常用的細胞模型，目前尚未見到T-2毒素對HK-2細胞毒性作用的研究，因此，本研究以體外培養的HK-2細胞為模型，探討不同濃度的T-2毒素對HK-2細胞增殖抑制、凋亡和周期分布等的影響，為闡明T-2毒素腎臟毒性作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HK-2細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。

T-2毒素(純度>98%)，青島普瑞邦生物工程有限公司；二甲基亞砜，德國Applichem公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、青霉素鏈霉素溶液，美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，東仁化學科技(上海)有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒、DNA Ladder抽提試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、碘化丙啶(PI)細胞周期檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；BD FACSVerse流式細胞儀，美國BD公司；酶標儀，美國BioTek公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；熒光倒置顯微鏡，德國Zeiss公司；高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；Gel Doc XR凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；萬分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.3 方法

1.3.1 10 mmol/L T-2毒素儲備液的制備

準確稱取0.010 g T-2毒素固體粉末，加入2 143.0 μL DMSO充分溶解后，置-20 ℃避光保存，備用。

1.3.2 HK-2細胞的培養

HK-2細胞常規培養于含10%(體積分數)胎牛血清和1%(體積分數)青霉素鏈霉素溶液的DMEM培養基中，置于含5% CO2的37 ℃培養箱。待細胞生長至對數生長期(80%～90%匯合度)時，胰酶消化傳代并進行后續實驗。

1.3.3 T-2毒素對HK-2細胞增殖抑制率的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養液調整細胞懸液濃度為2×104個/mL，按4×103個/孔接種于96孔培養板，每孔200 μL。取T-2毒素儲備液，用培養液分別配制終濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、250和500 nmol/L的毒素溶液，備用。待細胞過夜貼壁后棄去培養液，處理組每孔加入200 μL上述毒素溶液，對照組(含細胞)和空白組(不含細胞)加入200 μL培養液，每組設3個平行孔。培養箱中培養72 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，培養箱內繼續孵育1.5 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(A)，用公式(1)計算細胞的增殖抑制率。

(1)

式中，At為處理組的吸光度；Ab為空白組的吸光度；Ac為對照組的吸光度。

以細胞增殖抑制率為縱坐標，T-2毒素濃度的對數值為橫坐標，用Graphpad prism 6.0擬合曲線并獲得HK-2細胞半數抑制濃度(50% concentration of inhibition，IC50)。

1.3.4 T-2毒素對HK-2細胞形態的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養液調整細胞懸液濃度為4×104個/mL，按8×104個/孔接種于6孔培養板，每孔加入1 mL培養液和2 mL細胞懸液。取T-2毒素儲備液，稀釋至濃度為20.0 nmol/L，備用。待細胞過夜貼壁后棄去培養液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對照組加入3 mL培養液，每組設2個平行孔。置培養箱中培養72 h后，吸除培養液，加入0.5 mL固定液固定10 min后去除固定液，用PBS洗滌2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min后置熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.5 T-2毒素對HK-2細胞DNA片段化的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，處理同1.3.4。取T-2毒素儲備液，用培養液分別配制終濃度為10.0、 20.0、30.0和40.0 nmol/L的毒素溶液，備用。待細胞過夜貼壁后棄去培養液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對照組加入3 mL培養液，每組設2個平行孔。置培養箱中培養72 h后，吸除培養液至離心管，加入含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞，用PBS洗滌培養板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS再次洗滌，離心棄上清，加入200 μL PBS重懸細胞。隨后按照DNA Ladder試劑盒操作提取DNA，具體如下：加入4 μL RNase A，降解RNA；加入20 μL蛋白酶K，降解蛋白質；加入200 μL細胞裂解液，70 ℃水浴裂解細胞，釋放DNA；加入200 μL無水乙醇，沉淀DNA。將全部液體轉移至DNA純化柱內離心，洗滌液洗滌純化柱，除雜；加入洗脫液，溶解并洗脫DNA。將離心所得液體即純化的DNA進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DL15000+2000 marker作為對照，用凝膠成像儀拍照并觀察分析。

1.3.6 T-2毒素對HK-2細胞凋亡率的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養液調整細胞懸液濃度為1×105個/mL，按2×105個/孔接種于6孔培養板，每孔加入1 mL培養液和2 mL細胞懸液。取T-2毒素儲備液，用培養液分別配制終濃度為10.0、20.0、30.0和40.0 nmol /L 的毒素溶液，備用。待細胞過夜貼壁后棄去培養液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對照組加入3 mL培養液，每組設2個平行孔。置培養箱中培養72 h后，吸除培養液至離心管，加入不含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞，用PBS洗滌培養板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS再次洗滌，離心棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液混勻，室溫避光孵育10～20 min后用300目尼龍網過濾，1 h內用流式細胞儀上機進行檢測并分析結果。

1.3.7 T-2毒素對HK-2細胞周期分布的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，處理同1.3.6。置培養箱中培養72 h后，吸除培養液至離心管，加入含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞，用PBS洗滌培養板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用預冷的PBS重懸，再次離心棄上清。加入1 mL預冷的70%無水乙醇(體積分數)混勻，4 ℃固定過夜或-20 ℃固定1 h后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，預冷的PBS重懸，再次離心棄上清。加入細胞周期檢測試劑盒提供的0.5 mL染色緩沖液、25 μL PI染色液和10 μL RNase A混勻，37 ℃避光溫浴30 min后用300目尼龍網過濾，流式細胞儀上機進行檢測，采用ModFit LT軟件分析結果。

1.3.8 T-2毒素對HK-2細胞caspase-3活性的影響

取對數期生長良好的HK-2細胞，細胞處理同1.3.6。 消化細胞后，4 ℃、600×g離心5 min，收集細胞，PBS重懸，離心棄上清。加入細胞裂解液，置于冰浴裂解15 min后，4 ℃、20 000×g離心15 min，將上清轉移至冰浴預冷的干凈離心管中。取5 μL加入預先加有250 μL考馬斯亮藍G250染色液的96孔板中，混勻，用酶標儀測定595 nm處吸光度值，通過標準曲線計算細胞的蛋白濃度。用裂解液調整樣品蛋白質量濃度至1～3 g/L，取50 μL加入預先加有40 μL檢測緩沖液的96孔板中，隨后加入10 μL caspase-3反應底物，混勻，37 ℃溫浴2 h，用酶標儀測定405 nm處吸光度值，通過標準曲線計算caspase-3活性。

1.4 統計學分析

每個實驗重復3次。細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及各細胞周期細胞比例均以(x±s)表示，數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 T-2毒素對HK-2細胞的增殖抑制作用

四氮唑鹽比色法是目前應用較為廣泛的一種檢測細胞增殖活性的方法，它通過檢測細胞的氧化還原活性快速檢測細胞的增殖能力。CCK-8溶液中含有的水溶性四氮唑鹽WST-8可被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚，在450 nm處產生較強的吸收峰，且生成的甲瓚數量和活細胞數目呈正比，而死細胞對四氮唑鹽不具有此轉化能力[7]。因此，測定細胞在450 nm處的吸光度值，可間接反映活細胞的數量，進而獲得T-2毒素對細胞的增殖抑制率。將2.0、5.0、10.0、100、250和500 mmol/L T-2毒素濃度轉移為以10為底濃度對數后，經Graphpad prism 6.0擬合后得到的HK-2細胞增殖抑制曲線如圖1所示，20.0 nmol/L T-2毒素作用HK-2細胞72 h后即可抑制細胞增殖，抑制率為18.63%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，且細胞的抑制率隨T-2毒素濃度的增大而上升，當濃度增大至250 nmol/L時，T-2毒素對HK-2細胞的抑制率可達84.32%。結果表明，T-2毒素在20～250 nmol/L可以明顯抑制HK-2細胞的增殖，呈現劑量-效應關系。此外T-2毒素對HK-2細胞的IC50值為(49.34±1.33) nmol/L。因此，選取10.0、20.0、30.0和40.0 nmol /L作為T-2毒素作用濃度進行后續實驗。

圖1 HK-2細胞增殖抑制曲線Fig.1 Proliferation inhibition curve of HK-2 cells

2.2 T-2毒素對HK-2細胞形態的影響

細胞凋亡具有典型的形態學特征，包括細胞體積縮小，結構更加緊密；染色質逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊；細胞核固縮呈均一的致密物；細胞膜出芽突起，隨后形成大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體等[8]。Hoechst 33258藍色熒光染料可穿透細胞膜與細胞DNA雙鏈中的小溝結合，使細胞核著色。正常細胞的細胞膜完好，通透性差，染色質分布均勻；而凋亡細胞的細胞膜通透性增強，染色質固縮。因此，經Hoechst 33258染色后，正常細胞的細胞核呈均勻淡藍色弱熒光，凋亡細胞呈現強藍色熒光[9]。實驗發現，對照組HK-2細胞形態完整，邊緣光滑，呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，細胞核染色顏色較淺(圖2-A)；20.0 nmol/L T-2毒素處理組細胞細胞核染色較深，染色質固縮，呈碎塊狀或新月體狀的強藍色熒光(圖2-B)。

A-對照組；B-20.0 nmol/L圖2 HK-2細胞Hoechst 33258染色形態Fig.2 The Hoechst 33258 staining morphology of HK-2 cells

2.3 T-2毒素對HK-2細胞DNA片段化的影響

細胞凋亡晚期染色質固縮，Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內切酶的激活使得染色質DNA在核小體單位之間斷裂，形成大小50～300 kb的DNA片段，進一步分解成約180～200 bp整數倍的寡核苷酸片段[10]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測可觀察到梯形條帶(DNA Ladder)出現。因此DNA片段化被認為是檢測細胞晚期凋亡最直觀便捷的方法[11]。實驗發現，對照組和T-2毒素處理組細胞凝膠電泳均未見DNA Ladder出現，這說明10～40 nmol/L T-2毒素作用HK-2細胞72 h后未出現晚期凋亡或者晚期凋亡不明顯。

圖3 T-2毒素對HK-2細胞DNA片段化的影響Fig.3 Effect of T-2 toxin on DNA fragmentation of HK-2 cells

2.4 T-2毒素對HK-2細胞凋亡率的影響

細胞膜內側分布著磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內側外翻，暴露于細胞膜外表面。而Annexin是一類分布于真核細胞漿內的磷脂結合蛋白，與PS具有高度親和力，用綠色熒光探針FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC就可檢測凋亡細胞，結合PI可檢測壞死細胞這一特征，就可區分凋亡細胞和壞死細胞。用流式細胞儀檢測結果如圖4所示，統計結果見表1。實驗發現，與對照組相比，HK-2細胞經T-2毒素作用72 h后可使(3.84±1.61)%，(10.78±1.83)%，(17.28±7.19)%，(30.40±7.05)%的細胞出現早期凋亡，(3.85±1.46)%，(7.57±2.82)%，(4.84±1.76)%，(8.52±1.38)%的細胞出現晚期凋亡，處理組早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例均高于對照組早期凋亡(2.17±0.12)%和晚期凋亡(3.55±0.82)%的比例。此外，不同濃度作用后總凋亡細胞的比例分別為7.69%，18.35%，22.12%和38.92%，均高于對照組總凋亡細胞比例5.72%，且總凋亡細胞比例隨毒素濃度的增加而上升。由此可見，T-2毒素可誘導HK-2細胞凋亡，并呈劑量-效應關系，且主要為早期凋亡，這也與本研究發現的T-2毒素作用HK-2 細胞后未出現DNA Ladder實驗結果相一致。

A-對照；B-10 nmol/L；C-20 nmol/L；D-30 nmol/L：E-40 nmol/LUL-死細胞；UR-晚期凋亡細胞；LL-活細胞；LR-早期凋亡細胞圖4 流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of HK-2 cells detected by flow cytometry

表1 T-2毒素對HK-2細胞凋亡的影響Table 1 Effect of on T-2 toxin on apoptosis of HK-2 cells

T-2毒素濃度/(nmol·L-1)細胞比例/%活細胞死細胞早期凋亡細胞晚期凋亡細胞總凋亡細胞對照93.41±0.58a0.87±0.13b2.17±0.12a3.55±0.82a5.72c1089.33±0.64ab2.99±2.43ab3.84±1.61b3.85±1.46a7.69c2080.36±4.84b1.30±0.19ab10.78±1.83bc7.57±2.82b18.35b3068.38±9.42b9.5±4.2a17.28±7.19c4.84±1.76b22.12b4054.24±8.80c6.85±3.11a30.40±7.05c8.52±1.38b38.92a

注：同列上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.5 T-2毒素對HK-2細胞周期分布的影響

利用PI可與細胞雙鏈DNA結合后產生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比這一特性，可用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定。流式細胞儀檢測統計結果見表2。實驗發現，與對照組相比，HK-2細胞經T-2毒素作用72 h后，G0/G1期細胞比例分別由對照組的(64.50±3.00)%降低至(56.17±2.09)%，(54.78±1.31)%，(53.62±1.41)%和(52.40±1.37)%；S期細胞比例分別由對照組的(24.58±2.29)%增加至(30.19±1.36)%，(32.03±0.64)%，(31.25±0.66)%和(31.98±0.50)%；G2/M期細胞比例分別由對照組的(10.92±0.95)%增加至(13.65±1.34)%，(13.19±0.83)%，(15.14±1.01)%和(15.62±0.90)%?？梢姴煌瑵舛萒-2毒素作用細胞72 h后可影響HK-2細胞的周期分布，使G0/G1期細胞比例顯著下降，而S期和G2/M期細胞比例增加，引起細胞發生G2/M期阻滯。

表2 T-2毒素對HK-2細胞周期的影響Table 2 Effect of T-2 toxin on cell cycle of HK-2 cells

2.6 T-2毒素對HK-2細胞caspase-3活性的影響

caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的過程中發揮重要作用[12]。正常細胞內caspase-3存在于胞漿中，不具活性，但在凋亡的早期階段該蛋白可被家族中其他成員激活，裂解相應的底物，最終導致細胞凋亡[13]。

圖5 T-2毒素對HK-2細胞caspase-3活性的影響Fig.5 Effect of T-2 toxin on caspase-3 activity of HK-2 cells注：* 表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

從圖5可知，與對照組相比，HK-2細胞分別經10.0、20.0、30.0、40.0 nmol/L的T-2毒素作用72 h后，處理組細胞中caspase-3活性分別提高到1.15、1.53、 1.53和1.93倍，具有正的劑量依賴效應。

3 討論

T-2毒素作為單端孢霉烯族化合物中毒性最強的毒素，主要污染谷物及加工飼料。李思齊等[14]對魯北地區18家養殖場的全株玉米青貯飼料中霉菌毒素含量的調查發現，T-2毒素檢出率為100%。杜妮[15]對2013～2017年全國12個省份的玉米、豆粕、小麥、麩皮和飼料中霉菌毒素污染調查發現，T-2毒素陽性檢出率為66.85%～90.13%，平均值為38.9～49.9 μg/kg，污染程度較高，攝入風險較大。因此很多國家和地區制定了T-2毒素限量標準[16]，如加拿大提出豬和家禽飼料中T-2毒素建議容忍限量為1 000 μg/kg，我國在《飼料衛生標準》(GB 13078—2017)中規定植物性飼料原料和豬、禽配合飼料的最大允許量為0.5 mg/kg。因此，開展T-2毒素毒性研究可以為降低T-2毒素危害提供理論依據。

本研究CCK-8實驗發現，T-2毒素對HK-2細胞具有增殖抑制作用，這與很多文獻報道的T-2對體外培養的人和動物細胞增殖影響的結果相一致[17-18]，表明T-2毒素對HK-2細胞具有毒性作用。細胞周期和細胞凋亡是生物體內復雜而有序并受嚴格調控的過程，細胞周期調控紊亂在細胞損傷乃至癌變過程中起著至關重要的作用，而細胞增殖也是通過細胞周期調控來實現的。細胞周期的運行是在一系列稱為檢驗點(checkpoint)的嚴格監控下進行的，當DNA發生損傷，復制不完全或紡錘體形成不正常，周期將發生阻滯，使細胞在復制前(G0/G1期阻滯)和有絲分裂前(G2/M期阻滯)有足夠的時間進行有效的修復，修復成功的細胞進入細胞周期，修復失敗的細胞會發生凋亡，因此細胞周期調控對于維持細胞増殖、調亡及基因組穩定性有重要作用[19-20]。本研究發現，不同濃度T-2毒素作用HK-2細胞72 h后可影響細胞的周期分布，引起細胞發生G2/M期阻滯，但AGRAWAL等[21]研究發現T-2毒素可誘導人神經母細胞瘤細胞G0/G1期細胞周期停滯，兩項研究均表明T-2毒素可引起細胞周期阻滯，但其具體調控機制有待進一步研究。此外，流式細胞儀檢測結果表明T-2毒素作用可引起HK-2細胞凋亡，呈明顯的劑量效應關系；Hoechst 33258熒光染色也發現T-2毒素作用HK-2細胞后，細胞核染色質出現碎片和固縮現象，熒光染色增強，部分細胞可以觀察到明顯的凋亡小體，說明T-2毒素可誘導細胞凋亡，這與YUAN等[22]報道的T-2毒素對TM3細胞凋亡和WU等[23]報道熒光染色觀察結果相一致。DNA片段化也是伴隨細胞凋亡的主要生化特征，通過瓊脂糖凝膠電泳可觀察到特征性的梯形條帶。但另有研究發現DNA凝膠電泳雖特異性高但靈敏度低，不能檢測DNA輕微損傷及早期凋亡，且并不是所有細胞凋亡都有DNA Ladder出現，取決于細胞類型和一些特殊情況(如凋亡細胞DNA雙鏈斷裂時可觀察到梯形條帶，而單鏈斷裂時則觀察不到)[24]。本研究在HK-2細胞的對照組及處理組中均沒有觀察到DNA Ladder，結合流式細胞儀檢測結果可知，T-2毒素確實可以誘導HK-2細胞的早期凋亡。細胞凋亡是多基因調控下的復雜的主動死亡過程，其中caspase家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用。目前已發現的caspase家族成員有14個，根據caspase氨基酸序列的同源性及其作用性質主要分為3個亞型，分別作為細胞凋亡的活化者、執行者和炎癥介質反應的調節者參與細胞凋亡的過程[13]，其中caspase-3就屬于細胞凋亡的執行者，作為細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶在細胞內存在的兩條凋亡途徑：外源性凋亡途徑和線粒體途徑中均發揮重要作用。本研究發現T-2毒素作用HK-2細胞后caspase-3活性明顯升高，這也與LIU等[25]報道的T-2毒素可通過caspase-3活化引起GH3細胞凋亡的結果相一致。

綜上所述，T-2毒素對HK-2細胞具有明顯的增殖抑制作用，能夠誘導HK-2發生G2/M期阻滯，同時通過激活caspase-3活性而誘導HK-2細胞凋亡，有關細胞凋亡和細胞周期調控的分子機制有待進一步研究。