白術多糖的分子量及其單糖組成分析

王少杰，巴娟，張勇軍，鄧樺，蒲文珺，楊鴻

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院， 廣東 佛山 528231)

中藥白術為白術的根莖，切厚片生用或土炒、麩炒用，炒至黑褐色稱為焦白術。其性苦、甘、溫。歸脾、胃經。具有扶植脾胃、散濕除痹、消食除痞、安胎之功效。白術多糖作為中藥白術的主要活性成分具有免疫調節作用，能增加脾臟和胸腺的重量，增強小鼠脾淋巴細胞免疫功能，提高T淋巴細胞的轉化率和增殖反應，可調節巨噬細胞、白細胞功能，增強機體免疫應答[1-3]。白術多糖具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗腫瘤、促進胃腸粘膜損傷修復等作用[4-11]。白術多糖還可應用于抗菌消炎、抑制痢疾桿菌與傷寒桿菌、提高抗氧化功能、抑制紅細胞溶血、促發育、提高機體免疫力、抗腫瘤、抑制血液凝固、擴張血管、保護放射線侵害等諸多方面[12-14]。

中藥多糖的質量控制標準不完善(僅檢測總糖含量)，會對市場秩序產生一定的影響。本試驗通過對白術多糖的提取、純化，采用高效凝膠色譜(HPLC-GPC)法測定白術多糖的分子量大小及分布情況，采用薄層色譜(TLC)法及柱前衍生化HPLC法進行單糖組成種類和物質的量比的測定，為實現有效地對白術多糖進行質量控制提供了一種可靠的定性定量檢測方法，可作為白術多糖質量標準制定的參考與借鑒。

1 材 料

1.1 儀器 真空冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；RE-201D旋轉蒸發儀：鄭州予華儀器制造有限公司；雷蒙實驗室專用超純水機：重慶利迪實驗室儀器設備有限公司；HN1012超聲波清洗機：廣州市華南超聲設備有限公司；不銹鋼電熱去離子水器：上海傳勝實驗設備有限公司；XZ-1型真空泵：黃巖求精真空泵廠；BSA224S-CW電子分析天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：島津企業管理(中國)有限公司；島津DGU-20A系列高效液相色譜儀：島津企業管理(中國)有限公司；G1362A示差折光檢測器(RID)：安捷倫科技(中國)有限公司；雷磁PHS-3C PH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；H1650-W臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試劑 中藥白術購自北京同仁堂藥店佛山分店；AB-8大孔樹脂、無水乙醇均為分析純；D-甘露糖(批號：140651-201403)、鼠李糖(批號：111683-201502)、D-核糖(批號：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批號：111646-200301)、阿拉伯糖(批號：1506-200001)、D-木糖(批號：111508-200404)、果糖(100231-201305)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖(批號：201705)、D-半乳糖(批號：201705)對照品購自上海瑞楚生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)、鹽酸、氫氧化鈉、丙酮、正丁醇、異丙醇、乙酸乙酯、苯胺、二苯胺、磷酸均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

2 方 法

2.1 白術多糖的制備及含量測定[15]將中藥白術采用L9(34)正交試驗設計優化水提醇沉淀的提取工藝，提取條件為提取溫度90 ℃、料液比1∶16、提取時間1.5 h，重復提取3次。將提取的粗多糖經AB-8大孔樹脂純化濃縮，真空冷凍干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

2.2 白術多糖分子量與化學均一性檢測

2.2.1 色譜條件 島津DGU-20A系列高效液相色譜儀；G1362A示差折光檢測器(RID)；高效液相色譜柱：SB-806M HQ(8.0 mm×300 mm)；TSK PWXL保護柱(6.0 mm×40 mm)；流動相：超純水；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

2.2.2 進樣溶液配制 分別稱取9個T-dextran系列葡聚糖標準品(相對分子量7000-700000 Da)各2 mg，1 mL去離子水溶解，離心(6000 rpm，5 min)后取上清液，采用相同方法分別配制白術多糖溶液。

HPLC-GPC法測定多糖的數均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、Z均分子量(Mz)。由島津數據分析軟件分析處理得出。根據多糖樣品的色譜圖判斷多糖的化學均一性。

2.3 柱前衍生化HPLC法檢測白術多糖的單糖組成

2.3.1 水解多糖樣品 稱得兩份50 mg純化后的多糖樣品，分別放入不同的10 mL具塞試管與2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL混合均勻，置于97 ℃水浴鍋反應8 h，然后用4 mol/L NaOH調節PH至中性，離心并過濾。

2.3.2 多糖與單糖樣品衍生化 分別將5 mg的D-甘露糖、D-半乳糖、D-核糖、鼠李糖、D-葡萄糖、阿拉伯糖D-半乳糖醛酸定容于25 mL容量瓶中即可得到單糖標準品的混合樣品。取100 μL混合單糖標準品、 50 μL的0.3 mol/L NaOH溶液、50 μL的0.5 mol/L PMP 甲醇溶液充分混合，水浴加熱30 min。冷卻后加入 50 μL的0.3 mol/L HCl中和溶液，分別以1 mL 氯仿進行3次萃取，經0.22 μm微孔濾膜濾過，備用[16]。用同樣的方法進行衍生化處理白術多糖水解樣品100 μL。

2.3.3 色譜條件 Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)-乙腈(85∶15)；40 ℃柱溫；1.0 mL/min流速；20 μL進樣量；254 nm檢測波長。以混合單糖標準品和白術多糖水解樣品的衍生化產物進行測定，得到分離良好的色譜峰。

2.3.4 方法學試驗 精密度考察：取衍生化后的標準品連續進樣6次，以峰面積的RSD值考察試驗的儀器精密度；重復性考察：取衍生化產后的白術多糖樣品連續進樣6次；穩定性考察：取白術多糖的衍生化產物分別于0、2、4、8、16、24 h進樣。回收率考察：于樣品中分別加入樣品含量一半的100%、120%和150%的單糖標準品混合溶液進行測定。

2.3.5 線性試驗 分別進樣1、2、4、6、8、10 μL單糖標準品混合溶液，對各單糖用峰面積進行質量濃度回歸。

2.3.6 各單糖的物質的量比[17]計算方法：按式①、②計算兩種單糖之間的校正因子f1/2和這兩種單糖的比例R1/2。

① f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

A1、A2 分別為混合標準品溶液中單糖1、2 的峰面積，m1、m2 分別為標準品溶液中單糖1、2 的質量濃度。

② R1/2=f1/2×(A'1/A'2)

A'1、A'2分別為樣品中單糖1、2的峰面積。

3 結果與分析

3.1 白術多糖制備和含量測定 最佳提取條件為：浸提時間1.5 h、浸提溫度90 ℃、提取次數3次，之后抽濾、濃縮提取液，無水乙醇沉淀濃縮液12 h，取沉淀物經真空干燥，得白術粗多糖。經AB-8大孔樹脂純化的白術多糖含量可達91%以上。

3.2 白術多糖分子量及化學均一性檢測結果 經HPLC-GPC法檢測，白術多糖的化學均一性良好，基本呈現單一峰形，見圖1。經測定，白術多糖中Mw≈3500小分子多糖占其97%，Mw≈50000000的大分子占其3%；從多糖樣品的聚合物分散性指數(PDI)可以看出白術多糖的PDI較小，分子量分布較均勻，結果見表1。

表1 白術多糖分子量分布結果Tab 1 Results of molecular weight distribution of atractylodes macrocephala polysaccharide

圖1 白術多糖HPLC-GPC色譜及分子量分布圖Fig 1 HPLC-GPC chromatography and molecular weight distribution of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

3.3 柱前衍生化HPLC法檢測白術多糖的單糖組成結果

3.3.1 方法學試驗 精密度考察：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分別為0.38%、0.55%、1.34%、1.61%；穩定性考察：D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為0.46%、0.43%、0.69%、1.33%。表明樣品溶液在24 h內穩定。回收率試驗：計算得D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為98.8%，98.5%，98.6%，97.2%；RSD值為1.40%，0.30%，0.68%，1.18%。

3.3.2 線性試驗 對各單糖用峰面積進行質量濃度回歸，線性結果見表2。

表2 單糖標準曲線方程Tab 2 Standard curve equation of monosaccharide

3.3.3 單糖對照品與白術多糖的HPLC分析色譜圖 將單糖標準品混合樣品與白術多糖的衍生化產物進行HPLC分析，結果顯示：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分別在22.76、27.95、31.34、33.59、44.38、49.47、53.62 min左右出現吸收峰，見圖2；對比白術多糖圖譜，在部分相同的位置有吸收峰與其對應。可以確定白術多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖4種單糖組成，見圖3。

3.3.4 白術多糖的物質的量比 通過計算得出白術多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質的量比為1∶239∶18.6∶19.3，結果見表3。

表3 白術多糖中各單糖的物質的量比計算結果Tab 3 The ratio of the amount of monosaccharide substance in atractylodes macrocephalaon polysaccharides

1 D-甘露糖，2 D-核糖，3 鼠李糖，4 D-半乳糖醛酸，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose, 2 D-ribose, 3 Rhamnose, 4 D-galactose uronic acid, 5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar圖2 單糖對照品HPLC分析色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of monosaccharide control article

1 D-甘露糖，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose,5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar圖3 白術多糖HPLC分析色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

4 討論與結論

4.1 方法條件優化

4.1.1 提取工藝優化 中藥白術采用L9(34)正交試驗設計優化水提醇沉淀的提取工藝，得出的最佳提取條件為提取溫度90 ℃、料液比1∶16、提取時間1.5 h，重復提取3次；通過與三氟三氯乙烷法、Sevag法、酶法、三氯乙酸法、透析膜透析法等方法對比后，最終選擇純化效果最好的“AB-8大孔樹脂法”進行純化。

4.1.2 分子量測定方法的選擇 通過與黏度法、光散射法和超速離心沉降速度法等方法對比以后，選擇用GPC法測定白術多糖的分子量是因為GPC法相比之下測定更加精確，操作便捷，可以根據相關軟件快速準確地分析實驗結果。

4.1.3 白術多糖單糖組成方法的選擇 在用高效液相色譜法分析多糖組成及其含量時，由于多糖和單糖都不具有紫外吸收，無法直接對其進行測定，所以一般采用凝膠色譜柱與示差折光檢測器或蒸發光散射檢測器等儀器，這些方法不僅靈敏度低、基線噪音大、柱溫對結果影響較大、測定過程中易發生單糖轉化并且這些儀器與色譜柱價格高昂。因此本試驗先對YPF-P進行水解和衍生化處理，再采用高效液相色譜法(HPLC)分析其單糖組成及其物質量比，此方法不僅可以準確高效地測定白術多糖的單糖組成還極大地降低了檢測成本。

4.2 結論 通過對白術多糖的分子量測定，可以了解白術多糖的分子量大小以及分子量分布情況。通過柱前衍生化HPLC法對白術多糖進行單糖組成種類和物質的量比的測定，可以實現對白術多糖準確的定性定量。試驗通過對白術多糖的分子量大小與分布情況以及單糖組成分析，對白術多糖進行了定性定量的考查。試驗建立的方法穩定性高、重復性好、樣品用量少、容易操作。研究為白術多糖實現質量控制提供了一種可靠的定性定量的新思路。