抑制前扣帶皮層mTOR活性對福爾馬林炎性痛大鼠痛情緒的影響

陳娜蜜 蔣婧妍 任秋生 盧波

對于慢性病理性疼痛患者，疼痛的持續存在常使其產生嚴重的負性情緒反應[1]。研究表明，前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）與痛情緒的形成與維持密切相關[2-3]，然而目前對ACC調控痛情緒發生過程的分子機制尚不清楚。大量證據表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）參與多種形式的神經元突觸可塑性變化，包括長期記憶的形成、痛覺中樞敏化及海馬、脊髓背角神經元的長時程增強[4-7]。本研究擬觀察特異性抑制ACC腦區mTOR活性對福爾馬林炎性痛大鼠痛情緒反應的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清潔級SD大鼠24只，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，體重230～300g。本研究在實施前已獲得寧波大學實驗動物倫理委員會批準。所有實驗動物均飼養于寧波大學SPF級實驗動物中心。福爾馬林溶液（美國Sigma公司）；雷帕霉素（美國CST公司）；腦立體定位儀（深圳瑞沃德公司）；CPA訓練箱（安徽正華公司）；大鼠微量注射套管系統（深圳瑞沃德公司）。

1.2 慢性疼痛模型 將大鼠于異氟醚吸入麻醉下，在左側足底皮下注射5%福爾馬林溶液50μl，建立福爾馬林炎性痛模型。

1.3 實驗分組 將24只大鼠隨機分為3組，福爾馬林模型組（F組）、雷帕霉素組（R組）和DMSO組（D組），每組8只。所有大鼠均建立福爾馬林炎性痛模型，R組和D組于建模前20min經ACC套管注射相應藥物或溶劑，以觀察抑制ACC腦區mTOR活性對痛情緒和疼痛評分的影響。

1.4 立體定位ACC腦區置管給藥 大鼠麻醉后頭部固定于腦立體定位儀上，門齒桿-3.3mm。檢測是否固定成功的標準如下：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉。按照Paxinos&Watson圖譜[8]，ACC坐標為：AP:+2.6mm，L：±0.6mm，H：-2.5mm。用牙科鉆于進針點處鉆一小孔，深度至硬腦膜。將外套管緩慢植入，并以牙托粉固定于顱骨表面。待牙托粉凝固后，外套管塞入長度較套管長0.2mm的不銹鋼內芯并蓋上導管蓋。術后隔天插拔內芯一次，防止套管堵塞。

需給藥時，以異氟烷麻醉，將套管內芯拔出，插入注射內管，注射內管尖端長于套管0.2mm，末端通過PE-10軟管連接微量進樣器。雙側ACC給藥，每側注射0.5μl藥物或溶劑，其中雷帕霉素給藥量為每側7ng，溶劑為1%DMSO。在3min內注射完畢，隨后留針5min，防止液體溢出，使藥液充分擴散。

1.5 福爾馬林條件位置回避訓練（formalin-induced conditioned place avoidance，F-CPA） CPA訓練箱由3個小室組成，其中 A、B 室等大（30cm×30cm×30cm）并排放置，C 室為中間室（10cm×10cm×30cm），位于 A、B 室前方。3室之間的小門開放狀態下，大鼠可在3室任意穿梭。A室和B室在視覺和嗅覺信息上有著明顯差異：A室壁為黑白相間的垂直條帶，以1%醋酸溶液作為氣味劑；B室壁為黑白相間的水平條帶，以1%桂皮水作為氣味劑；C室內壁灰色，無特殊標記，亦無特殊氣味。

CPA訓練過程一共4d：第1天，將大鼠放入C室，待其進入A或B室后，關閉C室與A、B室間的小門，記錄15min內動物在A、B室的停留時間。第2天和第3天訓練過程相同，上午關閉3室所有小門，大鼠不經任何處理直接放入福爾馬林非條件匹配室，任其在內自由活動45min。下午，大鼠左側足底注射福爾馬林或生理鹽水后放入福爾馬林條件匹配室（A或B室，信封法隨機選擇），同樣使其在內45min后取出。第4天，操作過程同第1天，記錄大鼠15min內在A和B室所停留的時間。計算回避分數（訓練前后在福爾馬林條件室停留的時間差值）以評價大鼠是否形成條件性位置回避，回避分數越高提示痛情緒越顯著。

1.6 福爾馬林疼痛評分法 疼痛評分等級：0分：注射側足與非注射側足負重姿勢、位置無明顯差異；1分：注射側足不負重或輕微負重；2分：注射側足抬起，且完全離開測試箱底部平面；3分：出現甩足、舔爪、撕咬行為。每隔3min記錄1次大鼠在各個評分等級上的累積時間，每次記錄60s，持續觀察45min。累積疼痛評分按照下方公式計算，得到0～3分的疼痛評分：

1.7 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；同一組大鼠訓練前后比較采用配對t檢驗。對福爾馬林疼痛行為學表現，組間比較采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠痛情緒的比較 F組和D組大鼠訓練后在福爾馬林炎性痛匹配的條件室內停留時間明顯短于訓練之前（t=5.714、7.916，均P＜0.01）。而R組大鼠訓練前后在條件室內停留時間無統計學差異（t=1.287，P＞0.05 ）。3組大鼠回避分數比較差異有統計學意義（F=5.458，P＜0.05）。其中，R組回避分數顯著低于F組和D 組（t=3.235、2.200，均P＜0.05）。見表 1。

表1 3組大鼠痛情緒的比較

2.2 3組大鼠痛感覺的比較 3組大鼠間福爾馬林疼痛評分比較差異無統計學意義（F=1.041，P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠福爾馬林疼痛評分的比較

3 討論

研究證實，疼痛的感覺分辨組分和情緒體驗組分由不同的神經傳導通路傳導，并且最終對其進行整合、調控和處理的大腦腦區也并不完全相同[9]。神經元突觸可塑性是慢性疼痛產生的重要細胞機制，mTOR通過調節蛋白質的翻譯表達在其中起到關鍵作用[10-11]。近年來研究亦證實mTOR在脊髓水平參與突觸可塑性及慢性疼痛的形成過程[12-13]，但是對于mTOR是否在脊髓上中樞水平參與痛情緒的形成尚不清楚。ACC是邊緣系統中最大的一個腦區，臨床觀察、電生理實驗、人類腦功能成像以及動物ACC切除實驗均證實其與痛相關情緒的形成密切相關[2-3]。通過福爾馬林炎性痛與CPA行為學相結合的方法，本研究發現特異性抑制ACC腦區mTOR活性顯著削弱福爾馬林炎性痛大鼠的痛情緒反應，即mTOR信號通路是ACC調控痛情緒的重要分子機制。

F-CPA是將疼痛刺激誘導的負性情緒與背景環境相聯系從而建立的條件性記憶，因此雷帕霉素削弱痛情緒反應可能是由于痛情緒相關的“記憶”被破壞所致，類似于各種形式長期記憶的擦除。此外，大量證據表明ACC與諸多邊緣系統腦區（如杏仁核、腹側紋狀體、海馬和下丘腦等）存在直接或間接的連接，這些腦區與負性情緒的調控以及學習記憶密切相關[14-16]。因此，ACC中的mTOR也可能通過影響這些腦區域的相關信號通路進而調控痛情緒的形成和發展。進一步的研究可通過下調ACC中mTOR活性，同時檢測上述核團的神經元電生理改變來證實這一假設。

本研究結果還發現，在ACC內注射雷帕霉素并不影響福爾馬林炎性痛大鼠的傷害性感受行為（福爾馬林疼痛評分），提示疼痛的感覺組分不依賴于ACC內mTOR信號通路的活化，這與先前的研究結果相一致[17]。同時，這也提示了雷帕霉素對痛情緒的削弱作用不是通過阻斷了大鼠對福爾馬林痛感覺的分辨從而阻斷條件性回避行為的形成，而是作用于痛情緒本身。

綜上所述，抑制ACC腦區mTOR活性削弱福爾馬林炎性痛誘導的痛相關負性情緒。