ABCG2 mRNA的表達與乳腺癌蒽環(huán)類藥物化療效果的關(guān)系研究

徐象威 朱佩禎 張鵬海 陳銀巧 奚一源

乳腺癌是女性發(fā)病率最高且具有高度特異性、侵襲性的惡性腫瘤。2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球有近170萬女性被診斷為乳腺癌[1]。我國尚處于乳腺癌低發(fā)地區(qū)，是全球乳腺癌發(fā)病率最高國家（比利時）的 1/6，但自1998至2007年我國乳腺癌發(fā)病率增長1.2～2.8倍，且在過去30年中我國乳腺癌死亡率也增長了近1倍[2]?；煂τ谘娱L乳腺癌尤其是晚期乳腺癌患者生存時間具有重要意義。蒽環(huán)類藥物是乳腺癌化療中最常用的藥物，但由于個體的差異性，不同患者對蒽環(huán)類藥物的敏感性與耐藥性不同，臨床療效亦不同[3]。近年來腫瘤個體化治療成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點，如能預(yù)測患者對蒽環(huán)類藥物化療的敏感性，選擇合適的化療方案，或可提高腫瘤治療的臨床效果。研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2（ABCG2）與腫瘤化療耐藥、放療抵抗、激素治療不敏感等存在明顯關(guān)系[4-5]。ABCG2是多數(shù)化療藥物（拓撲異構(gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)類、喜樹堿類似物、酪氨酸激酶抑制劑及抗代謝藥物）的底物，可加速藥物從細胞內(nèi)泵出，降低腫瘤細胞中有效藥物濃度[6]。基于此，本研究通過分析乳腺癌患者蒽環(huán)類藥物化療前后ABCG2 mRNA的表達情況，探討其與化療效果的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年6月至2013年12月本院腫瘤內(nèi)科收治的乳腺癌根治術(shù)后接受蒽環(huán)類藥物化療的患者60例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)手術(shù)與病理學(xué)檢查確診為乳腺癌浸潤性導(dǎo)管癌者，經(jīng) CT、MRI證實具有1處或1處以上可測量的腫瘤病灶，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期進行分期；（2）心電圖和（或）左心室射血分數(shù)（LVEF）測定評分達標(biāo)；（3）患者肝腎功能檢查正常，均能達到化療的基本要求，患者的身體狀況評分（ECOG評分）0～2分；（4）預(yù)計生存期＞3個月，功能狀態(tài)評分（KPS評分）≥60分；（5）初始治療方案為以蒽環(huán)類藥物為主的聯(lián)合化療，且至少化療4個周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并2種及以上原發(fā)惡性腫瘤；（2）妊娠期女性；（3）存在嚴重內(nèi)分泌代謝及免疫疾病者。60例患者均為女性；其中年齡＞45歲36例，≤45歲24例；處于絕經(jīng)狀態(tài)33例，未絕經(jīng)狀態(tài)27例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ期21例，Ⅳ期14例；一般健康狀況評分（PS評分）0～1分 25例，2分35例。本研究經(jīng)永康市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會審查且批準(zhǔn)，患者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 化療方法與療效評判 患者入院后均給予標(biāo)準(zhǔn)的含蒽環(huán)類藥物聯(lián)合化療方案。包括：多西他賽/多柔比星/環(huán)磷酰胺（TAC）、多柔比星/環(huán)磷酰胺（AC）、多西他賽/環(huán)磷酰胺（TC）等?；颊呓邮?個周期化療后，通過腫瘤標(biāo)志物、B超、胸部CT或MRI等檢查評判化療效果。療效評判標(biāo)準(zhǔn)參照實體腫瘤療效評判標(biāo)準(zhǔn)[7]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、無變化（SD）、疾病進展（PD）。有效率=[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%，穩(wěn)定率=[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%。根據(jù)腫瘤對含蒽環(huán)類藥物聯(lián)合化療的反應(yīng)，將患者分為化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者?；颊弑憩F(xiàn)為經(jīng)蒽環(huán)類藥物化療后呈CR或PR視為高反應(yīng)，而化療后SD或PD視為低反應(yīng)。

1.2.2 ABCG2 mRNA表達水平檢測 （1）樣本采集：采集患者初次化療前、化療4個周期后的肘靜脈血5ml，標(biāo)注患者信息與采血時間。（2）采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（天根生化有限公司，批號：Q5704）提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。（3）將提取出的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fermentas公司，批號：00314956）合成cDNA產(chǎn)物，置于-20℃保存待測。（4）取上述所獲得的cDNA，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測化療前后ABCG2 mRNA表達水平。提取出的cDNA通過引物（上游：5′-GCGCAAGCTTATGTCTTCCAGTAATGTCGAA-3′；下游：5′-GCGCTCTAGATTAAGGGGAAATTTAAGAATA-3′）擴增目的基因。此后按照KAPA SYBR?FAST Real-time PCR Ki（tKAPA公司，批號：KK4601）的反應(yīng)體系加入試劑在ABI 7300 qPCR儀進行實時熒光定量完成ABCG2 mRNA表達水平檢測。以β-actin為內(nèi)參，采用相對定量法（ΔΔCt）對實時熒光定量PCR產(chǎn)物進行比較。ΔCt=Ct均值（目的基因）-Ct均值（管家基因）；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組 ΔCt；以 2-ΔΔCt計算 mRNA 表達水平的差異。

1.2.3 預(yù)后情況觀察 患者均進行為期5年的隨訪，主要通過電話隨訪、門診或住院病歷系統(tǒng)查詢等方式，統(tǒng)計預(yù)后情況。主要觀察終點為疾病無進展生存，疾病無進展生存期指自首次化療后至隨訪終止或疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間，主要通過醫(yī)院信息系統(tǒng)或患者直系親屬電話確認，末次隨訪時間截止2018年12月?；颊咴诨煰煶探Y(jié)束后每2個月隨訪1次以評估生存期。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察患者化療效果；（2）比較化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者臨床特征，包括年齡、月經(jīng)狀況、臨床分期、PS評分等；（3）比較化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平；（4）分析乳腺癌患者化療后ABCG2 mRNA表達水平與疾病無進展生存期的關(guān)系。以患者化療后ABCG2 mRNA表達水平中位數(shù)為界，分為ABCG2 mRNA高表達（表達水平≥中位數(shù)）患者與低表達（表達水平＜中位數(shù)）患者，比較ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者疾病無進展期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)化療前后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進展生存曲線，疾病無進展生存期的比較采用Wilcoxon秩和檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者化療效果 60例患者經(jīng)過4個周期的化療后，CR 9例，PR 28例，SD 18例，PD 5例；治療有效率為61.7%，穩(wěn)定率為91.7%?；煾叻磻?yīng)患者37例、低反應(yīng)患者23例。

2.2 化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者臨床特征比較 見表1。

表1 化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者臨床特征比較[例（%）]

由表1可見，化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者年齡、月經(jīng)狀況、臨床分期、PS評分等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平比較 見表2。

表2 化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者化療前后ABCG2 mRNA表達水平比較

由表2可見，組間比較，化療前，化療高反應(yīng)患者與化療低反應(yīng)患者ABCG2 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；化療后，化療后高反應(yīng)患者ABCG2 mRNA表達水平低于化療低反應(yīng)患者（P＜0.05）。組內(nèi)比較，化療高反應(yīng)患者化療后ABCG2 mRNA低于化療前（P＜0.05），而化療低反應(yīng)患者化療后ABCG2 mRNA表達水平高于化療前（P＜0.05）。

2.4 乳腺癌患者化療后ABCG2 mRNA表達水平與疾病無進展生存期的關(guān)系分析 本研究60例患者化療后ABCG2 mRNA表達水平中位數(shù)為1.24，ABCG2 mRNA高表達（表達水平≥1.24）患者與低表達（表達水平＜1.24）患者疾病無進展生存曲線見圖1。

由圖1可見，ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者中位疾病無進展生存期分別為47個月與54個月，ABCG2 mRNA低表達患者疾病無進展生存期長于高表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 ABCG2 mRNA高表達患者與低表達患者疾病無進展生存曲線比較

3 討論

蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌化療方案中最常用的藥物之一，無論在乳腺癌術(shù)前新輔助治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移解救治療還是在晚期乳腺癌輔助治療中都有非常重要的作用。但腫瘤細胞對產(chǎn)生化療藥物耐受性是影響化療效果及患者預(yù)后的首要原因，約90%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者化療失敗歸咎于多藥耐藥（MDR）。研究認為，ABC轉(zhuǎn)運體在乳腺癌細胞中的過度表達是造成MDR最常見的一種機制[8]。ABCG2是ABC超家族中ABC-G亞家族的第2個成員，因其首先在乳腺癌耐藥株（MCF-7/AdrVp）中被發(fā)現(xiàn)，亦稱為乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）[9]。ABCG2/BCRP是一種ATP依賴性轉(zhuǎn)運體，以同源或異源二聚體來發(fā)揮ATP依賴性藥物外排轉(zhuǎn)運體的作用，利用ATP水解產(chǎn)生的能量降低細胞內(nèi)藥物或內(nèi)源性及外源性細胞毒藥物濃度，產(chǎn)生特殊的藥物耐藥性[10]。

當(dāng)前有研究報道稱，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、食管癌、纖維肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤等的耐藥細胞株中ABCG2均存在過度表達，ABCG2蛋白在乳腺癌組織中陽性表達率、表達水平均明顯高于癌旁組織[11-12]。Qu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與化療前相比，化療后的殘存乳腺癌細胞膜上ABCG2呈高表達，這說明化療后乳腺耐藥相關(guān)蛋白的表達上調(diào)。王飛通等[14]發(fā)現(xiàn)，SW1990細胞經(jīng)過吉西他濱處理后，增殖能力明顯受抑制，呈時間依賴性減弱，而SW1990細胞中ABCG2蛋白與mRNA的表達成時間依賴性的升高，表明吉西他濱誘導(dǎo)ABCG2基因表達上調(diào)是造成腫瘤細胞逃避細胞毒藥物殺傷的機制之一。本研究結(jié)果顯示，化療高反應(yīng)患者ABCG2 mRNA表達水平均較化療前降低，而化療低反應(yīng)患者較化療前升高。這說明乳腺癌化療效果與患者ABCG2 mRNA表達水平呈負相關(guān)。這與Marzac等[15]的研究結(jié)果相似，其對急性髓細胞白血病患者規(guī)范化療后的隨訪發(fā)現(xiàn)，患者高表達ABCG2與完全緩解率、耐藥率和總生存率有顯著的相關(guān)性。分析可能原因，腫瘤患者化療后ABCG2基因的表達上調(diào)，當(dāng)達到一定程度時發(fā)揮外排泵功能，將進入細胞內(nèi)的化療藥物逆濃度梯度的轉(zhuǎn)運到細胞膜外，從而降低細胞內(nèi)藥物濃度，促使一些腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響化療效果。

ABCG2的表達與患者預(yù)后的關(guān)系研究已有報道。Ota等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)鉑類藥物化療的非小細胞肺癌患者的生存期較短，這與ABCG2的過表達有關(guān)，多因素分析顯示ABCG2的表達是影響疾病無進展生存期的獨立因素。何建明等[17]發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌ABCG2陽性表達患者的生存期與累計生存率均明顯低于ABCG2陰性者，ABCG2陽性表達率越高，其預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，ABCG2 mRNA表達水平與乳腺癌患者疾病無進展生存期有關(guān)，ABCG2 mRNA低表達患者疾病無進展生存期高于高表達患者；且化療高反應(yīng)患者疾病無進展生存期亦長于化療低反應(yīng)患者。

綜上所述，乳腺癌患者接受蒽環(huán)類藥物化療后，ABCG2 mRNA低表達患者其外排蒽環(huán)類藥物能力弱于高表達的患者，可使腫瘤細胞內(nèi)藥物保持在有效治療濃度，患者化療效果較好，且疾病無進展生存時間較長，預(yù)后較好。蒽環(huán)類藥物可誘導(dǎo)乳腺癌患者ABCG2 mRNA表達的改變，檢測其表達水平對于判斷乳腺癌患者化療效果與預(yù)后具有一定的參考價值。