R-Spondin2、Syndecan-1 在小鼠肝星狀細胞活化中的作用研究

殷新光 徐龍生 吳一鳴 薛文英 徐英

肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝臟合成細胞外基質的主要細胞，其活化可誘導細胞外基質合成與降解的失衡，導致肝纖維化的發生[1]。在慢性肝損傷中HSC要經歷增殖與表型的轉變，由原來富含維生素A類物質的靜止的表型“轉分化”為活化的肌纖維母細胞樣表型，即HSC發生活化[2]。在此過程中，多種信號通路參與，如 Wnt/p-catenin、Jagged/Notch 信號通路[3]。R-脊椎蛋白 2（roof plate-specific spondin-2，R-Spondin2）、多配體蛋白聚糖1（Syndecan-1）均是Wnt/p-catenin信號通路重要的調節分子[4-5]。基于此，本研究采用體外實驗研究的方法，探討R-pondin2、Syndecan-1在HSC活化中的作用及可能的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 24只8～10周齡健康雄性昆明種小鼠（江蘇齊氏實驗動物中心），體重38～40g。兔多克隆α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（美國R&D公司）；小鼠R-Spondin2抗體、小鼠Syndecan-1抗體、小鼠重組R-Spondin2蛋白、小鼠重組Syndecan-1蛋白（美國Sigma公司）；第二抗體（武漢博士德生物科技有限公司）；DMEM、Trizol和 FBS（美國 Invitrogen公司）；RIPA裂解液、逆轉錄試劑盒、鏈霉蛋白酶E、Ⅳ型膠原酶、SYBR試劑、BSA、DAPI（武漢博士德生物科技有限公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、紫外分光光度計（上海儀電分析儀器廠）、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠分組與HSC分離制備 將小鼠按隨機數字表法分為6組，每組4只，均在實驗室標準條件下飼養，自由攝取食物和水，適應性喂養1周。采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖出小鼠肝臟，用鏈霉蛋白酶E和Ⅳ型膠原酶灌流小鼠肝臟，Nycodenz密度梯度離心分離并培養原代小鼠HSC。細胞計數法測細胞得率，錐蟲藍拒染法測細胞存活率（確保存活率＞90%）。H1組：HSC分離培養 1d；H2組：HSC 分離培養 3d；H3組：HSC 分離培養7d；R+S-組：HSC分離培養24h后，給予20 ng/ml R-Spondin 2刺激24h；R-S+組：HSC分離培養24h后，給予 20 ng/ml Syndecan-1刺激 24h；R-S-組：HSC分離培養48h，未予任何刺激。分離的HSC以1×105個/cm2接種于含體積分數10%FBS的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養[6]。收集各組HSC進行后續實驗。

1.2.2 外源性R-Spondin2、Syndecan-1刺激 R+S-組、RS+組、R-S-組小鼠分離的 HSC HSC 以 1×105個/ml接種于96孔培養板，待細胞貼壁后，換無血清培養基培養24 h。對R+S-組HSC給予20 ng/ml重組R-Spondin2蛋白刺激24 h；對R-S+組HSC給予20 ng/ml重組Syndecan-1蛋白刺激24 h；R-S-組HSC僅分離培養48h。收集R+S-組、R-S+組、R-S-培養的HSC進行后續實驗。

1.2.3 各組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。RIPA裂解液提取各組HSC總蛋白，用紫外分光光度計測定蛋白質濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、5%脫脂奶粉封閉后，分別加入 R-Spondin2 抗體（1∶1 500）、Syndecan-1抗體（1∶1 000）和 α-SMA 抗體（1∶500），4℃孵育過夜。洗膜后加入第二抗體（1∶2 000），室溫孵育2h后采用電化學發光試劑檢測。以GAPDH為內參照，凝膠掃描成像系統（美國Bio-Rad公司）對各條帶的灰度值進行分析，檢測目的蛋白的相對表達水平。

1.2.4 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。PCR引物由上海齊合生物工程技術有限公司合成，見表1。Trizol法提取HSC總RNA，-80°C保存。紫外分光光度計測定260 nm和280 nm波長處的吸光度值，計算提取的總RNA濃度。用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，-20℃保存。PCR 體系：SYBR 試劑 10μl，濃度 10μmol/L的上、下游引物各 0.5μl，樣品 cDNA 2μl，雙蒸水 7μl。PCR 條件：95℃ 4min；95℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1 min，共35個循環；72°C延伸5 min。用SDS軟件進行數據分析，用比較Ct值（循環閾值）的方法分析結果，目的mRNA的相對表達水平由GAPDH進行標準化。

1.2.5 H1、H2、H3組小鼠HSC活化狀態觀察 采用免疫熒光染色法。待H1組、H2組、H3組細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1%Triton X-100透膜15min；PBS再次沖洗，然后在室溫條件下用4%BSA封閉細胞30min；按1∶150的比例稀釋α-SMA、Desmin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育過夜；PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀釋二抗，37℃條件下放置1h；用PBS沖洗3次，每次10min，最后DAPI染細胞核并用顯微鏡拍照觀察HSC活化狀態。

1.3 觀察指標 （1）觀察H1、H3組小鼠HSC活化狀態；（2）比較 H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與 mRNA表達水平；（3）比較 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2和Syndecan-1蛋白與mRNA表達水平；（4）比較R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 15.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物

2 結果

2.1 H1、H3組小鼠HSC活化狀態觀察結果 見圖1（插頁）。

由圖1可見，免疫熒光染色結果顯示H1組小鼠HSC α-SMA蛋白表達微弱，處于未活化狀態；H3組小鼠HSC，即HSC分離培養7d，α-SMA蛋白高度表達，具有肌細胞特征，有向肌成纖維細胞轉化趨勢，這說明HSC在體外培養時發生了從靜息到活化狀態的轉變。

2.2 H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與 mRNA 表達水平比較 見表2。

表2 H1、H2、H3組小鼠HSCα-SMA蛋白與mRNA表達水平比較

由表 2 可見，H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與mRNA表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），H3組小鼠HSC α-SMA蛋白與mRNA表達水平＞H2組＞H1組。即隨著HSC的活化，α-SMA蛋白與mRNA的表達水平上調且呈時間依賴性地上升。

2.3 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1蛋白與mRNA表達水平比較 見表3。

表 3 H1、H2、H3組 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1 蛋白與 mRNA表達水平比較

由表 3 可見，H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2 和Syndecan-1蛋白與mRNA表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），H3組小鼠HSC R-Spondin2蛋白與mRNA表達水平＞H2組＞H1組，而H3組小鼠Syndecan-1蛋白與mRNA表達水平＜H2組＜H1組。即隨著HSC的活化，R-Spondin2的表達上調并呈時間依賴性地上升，Syndecan-1表達下調且呈時間依賴性地下降。

2.4 R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達水平比較 見表4。

表 4 R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達水平比較

由表4可見，R-S+組小鼠HSC R-Spondin2蛋白表達水平低于 R-S-組小鼠 HSC（P＜0.05）。R+S-組、R-S-組小鼠HSC Syndecan-1蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC α-SMA蛋白表達水平比較差異有統計學意義（P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），R+S-組小鼠 HSC α-SMA 蛋白表達水平＞R-S-組＞R-S+組。即Syndecan-1負向調控R-Spondin2的表達，介導HSC的活化。

3 討論

肝纖維化是由不同病因引起的慢性肝病發生、發展的必經過程，對肝纖維化的預防和早期干預是穩定病情、防止肝纖維化向肝硬化、肝癌發展的有效措施[7]。因此，深入研究肝纖維化的發生、發展機制，對慢性肝病的防治具有重要意義。HSC是肝臟合成細胞外基質的主要細胞，其活化即發生肌成纖維細胞的表型轉換是肝纖維化發生的中心環節[8]。本研究以分離培養的小鼠HSC為研究對象，運用Western blot、RT-PCR、免疫熒光等檢測方法探討HSC活化過程中的相關機制，對闡明或阻斷HSC的活化，防治肝纖維化的發生具有重要意義。

HSC的活化受眾多細胞因子的調控，現有研究發現Wnt信號通路影響HSC的活化，阻斷Wnt信號通路可抑制HSC的增殖、誘導其凋亡[3]。R-Spondin蛋白家族是Wnt信號通路的重要調控因子，包括4種成員：RSpondin1、2、3、4。其序列相似度為 40%～60%，且具有相似的結構模式[9]。R-Spondin家族蛋白在消化道的組織分化、器官形成及疾病發生過程中發揮重要作用，RSpondin1對小腸表皮細胞生長有重要影響，而且RSpondin1能誘導小腸干細胞，對放化療有保護作用[10-11]。R-Spondin2-LGR5信號對結腸癌有抑制作用[12]。另有研究發現，由R-Spondin2介導的信號通路能夠調控致命腸道腹瀉的易感性[13]。上述研究表明在消化道發育和疾病發生過程中，R-Spondin對調控細胞的增殖、分化、遷移能力起著重要的作用。

本研究結果顯示，隨著體外培養HSC時間的延長，α-SMA的表達水平呈時間依賴性地上升，且免疫熒光染色顯示HSC分離培養到第7天，α-SMA蛋白高度表達，具有肌細胞特征，向肌成纖維細胞轉化趨勢，HSC發生了從靜息到活化的狀態轉變。在此過程中，RSpondin2的表達水平也隨時間延長而明顯上調。這提示R-Spondin2可能參與調控HSC的活化。

Sydecan-1屬細胞表面跨膜蛋白多糖，是膜表面黏附受體，屬于細胞間質、質膜的重要組成成分[14]。Sydecan-1以共價受體方式調節細胞與微環境之間的相互作用，參與組織器官發育、血管形成、組織再生等生理過程，它的表達受高度調節，具有細胞類型和發育階段特異性[15]。細胞利用整合素和Sydecan-1雙受體介導細胞-細胞外基質的黏附，促進細胞增殖，維持細胞分化類型，抑制腫瘤細胞生長[16]。本實驗研究結果發現，隨著體外培養HSC時間的延長，Sydecan-1蛋白與mRNA的表達呈時間依賴性地下降，Sydecan-1也可能參與調控HSC的活化。本研究結果還顯示，在HSC的活化過程中，R-Spondin2表達上調，而Syndecan-1表達下調。兩者是否存在于同一調控網絡內，與HSC的活化是何種關系，尚未見文獻報道。本研究對分離的小鼠HSC分別給予R-Spondin2、Syndecan-1重組蛋白刺激，結果顯示，RSpondin2蛋白刺激24h，α-SMA蛋白表達上調，而Syndecan-1表達差異無統計學意義；給予重組Syndecan-1蛋白刺激24 h，R-Spondin2、α-SMA蛋白表達均發生下降。因而筆者推測，R-Spondin2和Syndecan-1共同參與HSC的活化，并且Syndecan-1負向調控R-Spondin2的表達，從而促使HSC發生活化。

綜上所述，本研究結果顯示體外分離培養小鼠HSC，可使其發生活化，在此過程中，Syndecan-1表達下調，負向調控R-Spondin2表達上調，從而誘導α-SMA表達增加促使HSC活化。這提示結合R-Spondin2、Syndecan-1兩者相互研究，或將為闡明或阻斷HSC的活化，防治肝纖維化的發生提供實驗依據。