核殼結構Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+多功能納米復合材料的制備及其性能

隋晶婷 陳子禹 劉桂霞 宋 超 董相廷

(長春理工大學化學與環境工程學院，應用化學與納米技術吉林省高校重點實驗室，長春 130022)

0 引 言

近年來，鑭系元素摻雜的上轉換納米晶的發光性能和潛在應用受到了研究者的廣泛關注[1-7]。稀土氟化物具有較低的聲子能量以及較小的能量損耗，成為常用的上轉換發光材料的基質[8-15]。其中BaGdF5作為稀土氟化物中的一種，由于Gd3+特殊的4f電子構型，使其具有出色的發光和順磁特性[16-18]。

銀納米粒子具有表面等離子共振吸收[19]、較大的原子序數[20]、較長的成像時間和光熱轉換性能[21-22]，有潛力應用于計算機斷層掃描(CT)成像和腫瘤細胞的光熱治療領域[23]。目前，對腫瘤進行光熱治療的前期、中期和后期同時成像的納米診療試劑引起了人們的重視[24-28]。這種試劑能夠將成像和光熱治療結合[29-31]，顯著提高光熱治療的效率[32-34]。將具有光熱治療效果的銀納米粒子同具有上轉換發光性能的BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米晶結合，合成具有磁-光-熱多功能的復合納米材料有潛力成為一種多模式成像的診療試劑，應用于多模式成像指導的光熱治療領域。

采用一種簡單的液相法制備了核殼結構的Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料，這種納米復合材料結合了光熱治療和雙模式成像功能，有潛力成為一種新型的納米診療平臺。研究了納米復合材料的磁、光、熱特性，通過MTT試驗確定納米復合材料的生物相容性，進一步研究了納米復合材料的雙模式成像以及在對腫瘤細胞的光熱治療領域的應用。

1 實驗部分

1.1 Ag納米粒子的制備

將200 mg的AgNO3和1 g PVP(K30)溶解在35 mL乙二醇中，于室溫下持續攪拌得到混合溶液，隨后將其加熱到130℃，持續反應1 h，混合物被冷卻至室溫。產物用大量的丙酮沉淀，然后離心分離(8 000 r·min-1，10 min)，再用去離子水和乙醇分別洗滌3次，得到Ag納米粒子，將其分散在乙醇中，備用。

1.2 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的制備

首先向稀土氧化物(0.01 mol的 Gd2O3、0.005 mol的Yb2O3和Ho2O3)中分別加入15 mol·L-1硝酸溶液，在加熱攪拌下使其溶解，除去多余硝酸后，在室溫下分別加入100 mL去離子水，配成濃度為0.1 mol·L-1的 Gd(NO3)3、0.05 mol·L-1的 Yb(NO3)3和Ho(NO3)3溶液。取50 mL制備的Ag納米粒子溶液，在攪拌過程中加入3 mmol檸檬酸鈉，隨后加入已配制 的 2.34 mmol Gd(NO3)3、0.6 mmol Yb(NO3)3、0.06 mmol Ho(NO3)3溶液，在室溫下持續攪拌30 min。取0.488 52 g的BaCl2·2H2O直接加入到上述溶液中，繼續攪拌5 min，最后逐滴加入10 mL的NH4F(2.1 mol·L-1)，室溫下攪拌 1 h。在 8 000 r·min-1轉速下將生成的產物離心收集。隨后用去離子水和乙醇洗滌3次后，將沉淀放入60℃干燥箱中干燥6 h得到樣品。

1.3 表征方法

采用Bruker D8 FOCUS型X射線衍射儀(XRD)對樣品的相結構和純度進行分析，Cu Kα輻射(λ=0.154 056 nm)，測量的角度(2θ)范圍為 10°～90°，掃描速度為6°·min-1，工作電壓為30 kV，工作電流為20 mA。采用JSM-7610F型場發射環境掃描電子顯微鏡(SEM)和JEOL-2000EX型透射電子顯微鏡(TEM)，對樣品的形貌和尺寸進行分析，工作電壓為15 kV。采用FEI公司生產的OXFORD ISIS-300型能量色散光譜儀對樣品組成進行分析。采用SHIMADZU UV-2450型分光光度計對樣品進行紫外-可見吸收光譜測試，波長范圍為200～1 000 nm。采用HITACHI F-7000型熒光光譜儀對樣品進行熒光分析，以MWLW 980 nm半導體激光器作為激發光源，光電倍增管(PMT)電壓為700 V。采用美國生產的MPMS SQUID XL型振動樣品磁強計對樣品進行磁性分析，外加磁場范圍為-20～20 kOe。采用980(1.2 W·cm-2)和808 nm激光器(1.0 W·cm-2)對一系列不同濃度樣品的水溶液進行照射，水溶液溫度的變化分別通過HTC3500C溫度傳感器和紅外熱成像相機進行記錄。

1.4 細胞毒性實驗

采用MTT比色法對樣品的生物相容性進行評估，以HeLa細胞作為實驗細胞。首先，將HeLa細胞在96孔板中于5%(V/V)CO2和37℃的環境下培養24 h；然后將細胞與不同濃度的樣品溶液繼續培養24 h，每個濃度做3組平行實驗；最后將100μL溶解在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的MTT加入到每一個孔中，孔板在37℃下繼續培養4 h，培養結束后，用PBS溶液進行清洗，再向每個孔中加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)。利用酶標儀在波長為490 nm下測量吸收值。細胞活性計算公式:其中，CV為細胞存活率；ODNCs為與納米復合材料共同培養的HeLa細胞在酶標儀檢測下的吸光度；OD為未處理的對照組的HeLa細胞在酶標儀檢測下的吸光度。

1.5 上轉換熒光成像(UCL)實驗

采用外接一個980 nm激光器的共聚焦熒光顯微鏡來觀察細胞的體外上轉換熒光成像。首先，HeLa細胞被種在6孔板上，在5%(V/V)CO2和37℃的環境下培養24 h；將細胞用PBS洗滌3次后，再加入所制備的樣品繼續培養6 h；最后用PBS洗滌將多余的樣品去除。通過共聚焦顯微鏡記錄細胞的明亮場和上轉換熒光成像圖片。

1.6 CT實驗

采用CT成像系統 (Bruker)來測試細胞的體外CT成像。首先將制備的樣品和碘比醇分散在去離子水中形成不同濃度的水溶液，將其倒入2 mL的離心管中放入CT成像系統。成像參數如下:厚度為0.9 mm，電壓為82 kV，管電流為500μA。

1.7 光熱治療(PTT)實驗

采用熒光素二乙酸酯(FDA)/普羅匹定(PI)共染實驗評估納米復合材料的光熱治療效果。首先，HeLa細胞被種在96孔板上，在37℃下培養24 h；然后與樣品在同樣的環境下繼續培養12 h。用808 nm激光照射共同培養過后的細胞5 min；最后將處理后的細胞用FDA和PI共同染色30 min。通過共聚焦熒光顯微鏡記錄細胞的生存死亡比。

2 結果與討論

2.1 X射線衍射(XRD)分析

圖1為所制備樣品的XRD圖。圖1(a)表明所制備的Ag納米粒子的所有衍射峰的位置和強度都與Ag的標準卡片(PDF No.04-0783)相匹配，沒有其他衍射峰出現，說明所制備的Ag納米粒子為立方相。由圖 1(b)可知，所制備的 BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子在 26°、30°、43°、51°和 53.5°處有衍射峰出現， 分別對應立方相 BaGdF5的 (111)、(200)、(220)、(311)和(222)晶面，衍射峰的數據與立方相的BaGdF5(PDF No.24-0988)基本一致，同時觀察到衍射峰向高角度位移，這是由于Yb3+、Ho3+的離子半徑小于Gd3+的離子半徑，Yb3+、Ho3+摻入到晶格中取代Gd3+后導致晶胞體積的縮小，從而使得納米復合材料的衍射峰相對于BaGdF5的標準卡片向高角度發生位移。圖1(c)中可以觀測到BaGdF5的衍射峰和Ag的衍射峰，說明合成了 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料。

圖 1 (a)Ag納米粒子,(b)BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米粒子,(c)Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納 米 復 合 材 料 的 XRD圖以及Ag和BaGdF5的標準卡片Fig.1 XRD patterns of the samples(a)Ag nanoparticles,(b)BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanoparticles and(c)Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites;Standard cards of Ag(PDF No.04-0783)and BaGdF5(PDF No.24-0988)

2.2 電子顯微鏡和能譜分析

圖2 (a)為制備的Ag納米粒子的SEM照片，從圖中可以看出Ag納米粒子為球形，表面光滑，結合圖2(b)的粒徑分布直方圖可知Ag納米粒子的平均直徑為 77 nm。 由 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的SEM照片(圖2(c))可知包覆后顆粒仍為球形，表面粗糙。結合納米復合材料的粒徑分布直方圖(圖2(d))可知，復合材料的平均直徑增大，約為106 nm。為了更清晰地觀察其形貌，對其進行了TEM測試。由圖2(e)的TEM照片可見明顯的核殼結構，殼層厚度約為14 nm，進一步說明Ag納米粒子表面包覆上了 BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子。 圖 2(f)的 EDS 分析表明納米復合材料包含 F、Er、Ba、Gd、Yb、Ag、Si和 Au元素(Au元素來源于制樣過程中的噴金過程)。上述結果證明成功合成了 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料。

2.3 光學性質分析

圖2 Ag納米粒子 (a,b)和Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料 (c,d)的SEM照片和粒徑分布直方圖;Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料的TEM照片 (e)和EDS能譜圖 (f)Fig.2 SEM images and histograms of size distribution of Ag nanoparticles(a,b)and Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites(c,d);TEM image(e)and EDS spectrum(f)of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites

圖 3 是 BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子和 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的上轉換發射光譜圖。從圖中可以看出樣品中均存在2個發射譜帶，分別位于540和647 nm，對應Ho3+離子的5S2/5F4-5I8和5F5-5I8躍遷。 與 BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子相比，復合粒子的上轉換發光強度降低，并且540 nm的綠光發射下降明顯。結合圖3(c)的Ag納米粒子的紫外-可見吸收光譜圖分析，Ag納米粒子在428 nm附近強的局部表面等離子體共振吸收峰與BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子的綠光發射部分重疊，造成了二者之間的能量傳遞，BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米 粒子作為能量給體，Ag納米粒子為能量受體，在980 nm激發下，BaGdF5∶Yb3+，Ho3+發射的綠光部分被 Ag 納米粒子吸收，導致綠光發射強度明顯降低。

為了分析 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的上轉換發光過程，研究了納米復合材料中Ho3+的特征躍遷的發射強度(IUC)隨泵浦功率(P)的變化，二者關系如下:

圖 3 BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米粒子 (a)和 Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料 (b)的上轉換發射光譜(λex=980 nm);Ag納米粒子的紫外可見吸收光譜(c)Fig.3 Upconversion emission spectra(λex=980 nm)of BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanoparticles(a)and Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites(b);UV-Vis spectrum of Ag nanoparticles(c)

其中n代表光子數。圖4為泵浦功率對Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料發光強度的雙對數點圖。從圖中可以看出納米復合材料在5S2/5F4-5I8(540 nm)躍遷和5F5-5I8(647 nm)躍遷處的斜率分別為1.64和1.89，均接近于 2，說明 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的Ho3+的紅光和綠光躍遷為雙光子過程。

圖4 Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料的綠光和紅光發射強度的功率依賴關系圖Fig.4 Pump power dependence diagram of green and red emission intensity of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites

圖 5 是 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料可能的上轉換發光過程和能量傳遞示意圖。Yb3+離子先吸收980 nm的光子，躍遷到2F5/2能級，處于激發態的Yb3+離子通過能量的轉移(ET)傳遞給Ho3+離子，Ho3+離子吸收能量，產生了綠光(540 nm，5S2/5F4-5I8)和紅光(647 nm，5F5-5I8)發射。由于Ag納米粒子的等離子體共振(SPR)吸收峰同Yb3+/Ho3+的綠光發射有重疊，使兩者之間發生能量傳遞。

圖5 Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料的上轉換過程的能級圖Fig.5 Energy level diagrams of upconversion process of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites

2.4 磁性分析

圖 6 為 BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子和 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的磁滯回線，從圖中可知，在室溫下的納米粒子和復合材料均呈現順磁性，磁化強度分別為1.28和1.16 emu·g-1。磁化強度的降低歸因于引入了不具有磁性的貴金屬Ag后，降低了磁性物質所占的比例。

圖 6 BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米粒子 (a)和 Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料 (b)的磁滯回線Fig.6 Hysteresis loops of BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanoparticles(a)and Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites(b)

2.5 光熱性能分析

為了證明 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的熱效應，將其水溶液用980 nm激光進行照射，測量其溫度變化。圖7(a)顯示了用980 nm激光照射10 min 后去離子水、BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子、Ag納米粒子和 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合粒子溶液的溫度變化。從圖中可以看出去離子水和BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米粒子的溫度從19℃分別上升到23和24℃，同時，Ag納米粒子的溫度從19℃上升到31.8℃，而 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的溫度則從19℃增加到了39℃，說明納米復合材料溫度上升的主要原因是Ag納米粒子吸收光后轉變為熱量。 同時研究了不同濃度的 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的水溶液在980 nm激光照射10 min后的溫度變化關系圖(圖7(b))。從圖中可以看出隨著納米復合材料濃度的增加，懸浮液溫度上升，這說明改變 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的濃度，其溫度也會發生改變。圖7(c)為在808 nm激光照射下，Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的近紅外成像照片。Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料在 808 nm NIR照射5 min后溫度從22.0℃上升到59.1℃，并且隨著輻射時間的增加，納米復合材料的溫度會繼續上升。 這表明 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料有望應用于腫瘤細胞的光熱治療領域。

圖7 在980 nm激光照射下,去離子水、BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米粒子，Ag納米粒子和Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合粒子的溫度變化曲線 (a);不同濃度的Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料的升溫變化曲線 (b);808 nm激光照射下納米復合材料的近紅外成像照片(c)Fig.7 Temperature variation curves of water,BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanoparticles,Ag nanoparticles and Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites(a);Heating effect of nanocomposites with different concentrations of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+(b)under 980 nm laser irradiation;Infrared images of nanocomposites under 808 nm irradiation(c)

2.6 MTT實驗分析

細胞毒性是材料能否應用于生物領域的關鍵因素，選用HeLa細胞作為試驗細胞進行MTT試驗評估 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的毒性。 圖 8是利用不同濃度的 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料分別培養HeLa細胞24 h。從圖中可以看出納米復合材料的濃度達到1 mg·mL-1時，細胞成活率可以達到 79%。MTT 試驗說明 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料對細胞的毒性很小，可以應用于生物領域。

圖8 HeLa細胞同不同濃度的Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料共同培養24 h的細胞活性直方圖Fig.8 Cell viability histogram of HeLa cells incubated with different concentrations of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites for 24 h

2.7 上轉換熒光成像

選取HeLa細胞作為對象，研究了Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料的上轉換熒光成像。將納米復合材料加入到細胞中培養6 h后，采用共聚焦熒光顯微鏡可采集到細胞呈現明亮的綠光信號(圖9(b))，并且從圖9(c)中觀察到細胞吸收了納米復合材料，材料存留在細胞質中，表明所制備的納米復合材料能夠應用于癌細胞的上轉換成像研究。

圖9 同Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料共同培養的HeLa細胞在980 nm激光照射下的上轉換成像照片Fig.9 UCL imaging images of HeLa cells incubated with Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites under 980 nm excitation

2.8 CT成像

Ag和Gd元素具有較大的原子序數，能夠成為CT成像的造影劑，測試了不同濃度的商用造影劑碘比醇ガ和 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料(NCs)的CT成像照片，如圖10(a)所示。CT信號強度隨著樣品濃度(C)的增加而增強。圖10(b)為不同濃度的Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料和碘比醇對應的hounsfield unites(HU)值，分別用 k1和 k2來表示斜率。由該圖可見，k1和k2分別為10.86和5.0，說明同碘比醇相比，納米復合材料具有較高的CT造影能力。因此，納米復合材料能夠作為CT成像的造影劑。

圖10 不同濃度的Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料和碘比醇的CT圖像 (a)和HU值的線性對比圖 (b)Fig.10 CT imaging images(a)and HU values(b)of Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites and iobitridol with different concentrations(a)

2.9 光熱治療分析

由于Ag納米粒子具有光熱轉換性質，為了證實復合材料能夠作為光熱治療試劑使用，采用FDA/PI共染研究來評估其光熱治療效果。將HeLa細胞同納米復合材料共同培養后在808 nm激光下照射5 min，通過共聚焦熒光顯微鏡進行表征(圖11)。由圖可見，在磷酸鹽緩沖溶液控制組中，用808 nm激光照射，細胞沒有明顯的死亡現象。將納米復合材料同HeLa細胞共同培養，沒有激光照射時，HeLa細胞幾乎沒有死亡，這也說明納米復合材料具有很好的生物相容性。當用808 nm激光照射后，發現大量細胞死亡。說明納米復合材料在NIR照射下會產生熱，生成的熱足以殺死大部分腫瘤細胞。進一步說明了 Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料有潛力應用于光熱治療領域。

圖11 Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+納米復合材料共同培養的FDA/PI共染的HeLa細胞在808 nm激光照射5 min后的共聚焦圖像Fig.11 Confocal images of FDA/PIco-staining HeLa cells incubated with Ag@BaGdF5∶Yb3+,Ho3+nanocomposites under 808 nm laser irradiation for 5 min

3 結 論

通過簡單的液相法成功合成了核殼結構的Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料。 該復合材料為球形，平均直徑為106 nm。同時具有良好的生物相容性、順磁性、上轉換發光和光熱轉換性能，可應用于上轉換熒光成像、CT成像。在NIR照射下，納米復合材料能夠生成大量的熱，有效殺死癌細胞。因此Ag@BaGdF5∶Yb3+，Ho3+納米復合材料在腫瘤細胞的雙模式成像指導的光熱治療方面有潛在的應用。