5-氟尿嘧啶卟啉錳/鋅配合物的合成、光電性質及抗癌活性

任麗磊 彭曉霞 王樹軍 肖立偉 李澤強

(廊坊師范學院化學與材料科學學院，廊坊 065000)

5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床使用的廣譜抗癌藥物，它能抑制胸苷酸合成酶，干擾DNA和RNA的合成，已成功應用于腸癌、胃癌、乳腺癌等實體癌的治療[1]。但由于首過代謝顯著、脂溶性低、對癌細胞選擇性差，影響抗腫瘤療效。為了降低其毒副作用，科研工作者對5-FU進行了大量的化學修飾[2-4]，結果表明，將5-FU適當衍生化，可提高其選擇性，降低毒副作用。

另一方面，卟啉及金屬卟啉是一種重要而特殊的物質，具有獨特的生物活性。對卟啉進行功能分子設計、合成，在光動力療法[5-6]及抗癌方面[7-8]備受關注，有著十分廣闊的應用前景。利用卟啉對惡性腫瘤有特殊的親和力[7]這一特點，將其與抗癌藥物相連，組成卟啉-抗癌藥物的二元體系，是近年來卟啉化學的研究熱點之一，這種二元體系包括卟啉-BNCT體系，卟啉-順鉑體系，卟啉-蒽醌體系[9-11]等。研究表明，組合分子的抗癌療效遠遠大于2種藥物同時使用時的療效。

基于這些考慮，本文合成了一種新型的5-氟尿嘧啶卟啉化合物(L)及其錳配合物(MnL)、鋅配合物(ZnL)，對目標化合物的結構進行了表征，研究了它們的光、電性質和抗癌活性。以期為篩選新的抗癌藥物提供一定的基礎數據支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

BRUKER AVANCE 400型核磁共振儀；Agilent 6520 QTOF LC/MS質譜分析儀；Shimadzu-2550紫外-可見分光光度計；WGY-10型熒光分光光度計；Prestige-21傅立葉變換紅外光譜儀；CHI660C電化學工作站。

吡咯和 1，2-二溴乙烷 (使用前重蒸)，5-氟尿嘧啶(用前重結晶)，所有試劑均為市售分析純。5-鄰羥基苯基-10，15，20-三苯基卟啉(A)和 5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉(B)參照文獻[12]合成。

1.2 化合物的合成

目標化合物的合成路線如Scheme1所示。

Scheme 1 Synthetic routes of the ligand and complexes

1.2.1 5-(2-(5-氟尿嘧啶-3-基)乙氧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉(L)的合成

在100 mL干燥的圓底燒瓶中，加入130 mg(1 mmol)5-氟 尿 嘧 啶 和 30 mL N，N-二 甲 基 甲 酰 胺(DMF)，攪拌使之溶解。加入焙燒過的無水K2CO3166 mg(1.2 mmol)，于 80 ℃攪拌 1 h，使 5-氟尿嘧啶生成鉀鹽。然后加入88 mg(0.12 mmol)5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉，升溫至 120 ℃，攪拌，10 h后停止。飽和NaCl溶液鹽析，抽濾，蒸餾水洗滌，干燥。粗產品用柱色譜分離，用氯仿與丙酮體積比為4:1的混合液淋洗，收集第二色帶，旋蒸干燥，得紫色晶體L 23 mg，產率為22%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ-2.74(s，2H，Pyrrole N-H)，4.10～4.12(t，2H，OCH2)，4.30～4.31(t，2H，-NCH2)，7.75～7.78(m，4H，ArO-o，m，p-H),7.99(s，1H,C-H in 5-FU),8.21～8.31(m,15H,Ar-H),8.81～8.83(m,8H,Pyrrole-H)；HRMSESI(m/z):[M+H]+787.282 6，按 C50H35FN6O3計算值:787.282 7；UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):418(3.66×105)，514(1.46×104)，549(4.87×103)，589(3.41×103),644(1.95×103)；IR(KBr,cm-1):ν(NH)3 471，ν(CH)2 924，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 517，ν(COC)1 136。

1.2.2 金屬配合物MnL、ZnL的合成

在50 mL圓底燒瓶中，加入25 mg(0.032 mmol)化合物 L、20 mL二氯甲烷，再加入 63 mg(0.32 mmol)氯化錳溶于甲醇制成的飽和溶液，電磁攪拌下回流，反應1 h。冷卻，蒸餾水洗滌，分液。有機層水浴蒸干。粗產品用氯仿與丙酮體積比為4∶1的混合液洗脫。收集最濃綠色帶，旋蒸濃縮，干燥得綠色固體MnL 17 mg，產率為63.6%。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+839.197 0,按C50H33FN6O3Mn計算值:839.197 3;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):478(1.67×105)，580(1.15×104)，622(1.03×104)；IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 412，ν(CH)2 922，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 570,ν(COC)1 240，ν(Mn-N)1 010。

按上述方法，用59 mg(0.32 mmol)乙酸鋅代替氯化錳，得紫紅色固體ZnL 21.8 mg，產率為80.3%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ4.12～4.13(m，2H，OCH2),4.22～4.30(m，2H，-NCH2),7.60～7.64(m，4H，ArO-o，m，p-H)，7.85(s，1H，C-H in 5-FU)，8.18～8.24(m，15H，Ar-H)，8.67～8.69(m，8H，Pyrrole-H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+848.188 4,按C50H33FN6O3Zn計算值:848.188 4;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):419(3.83×105),547(1.48×104),583(1.23×103);IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 471,ν(CH)2 924,ν(CO)1 637,ν(C=C)1 575，ν(COC)1 261，ν(Zn-N)997。

1.3 熒光光譜的測定

以三氯甲烷為溶劑，配制濃度為10μmol·L-1的溶液進行熒光光譜的測定。熒光光譜測試條件:室溫，樣品池為1 cm×1 cm×4 cm石英池，激發狹縫10 nm，發射狹縫10 nm，激發波長為420 nm，負高壓:450 V，掃描范圍:550～750 nm。

1.4 電化學測試

本實驗中循環伏安法實驗條件如下:采用三電極體系，玻碳電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。以二氯甲烷為溶劑，樣品濃度為 1 mmol·L-1,支持電解質為 0.1 mol·L-1四丁基高氯酸銨，掃描速率50 mV·s-1，測定前用高純氬氣除去體系中的氧氣，在氬氣氣氛下進行循環伏安測試。

1.5 抗癌活性測試

胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所，RPMI-1640培養液購自Invitrogen公司，SRB購自Sigma公司，酶標儀(MD公司，M5型)。人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株Bel-7402和人結腸癌細胞株HCT-8均購自中國醫學科學院基礎研究所細胞中心。

應用磺酰羅丹明B蛋白染色法(SRB法)檢測目標化合物對癌細胞(A549、Bel-7402和HCT-8)增殖生長的抑制作用。步驟如下:接種對數生長期細胞于96孔培養板中，37℃，5%(V/V)CO2培養24 h。藥物處理孔加入10μL樣品溶液 (終濃度:化合物為5 μg·mL-1；混合物為 50 μg·mL-1)，陽性藥物孔加入終濃度為5μg·mL-1的5-FU進行處理；對照孔加入含等體積溶媒的培養基，37℃，5%(V/V)CO2培養72 h。棄去培養基，輕輕加入100μL 4℃預冷的50%TCA固定細胞。先靜置5 min，然后再移至4℃放置1 h。倒掉固定液，蒸餾水洗滌5次去除TCA，空氣干燥1 h。每孔加入0.4%SRB溶液80μL，室溫染色30 min。棄染液，1%醋酸洗滌5次充分去除未結合的SRB，空氣干燥。加入150μL 10 mmol·L-1Trisbase(pH=10.5)溶解，用M5酶標儀于510 nm波長下測定OD值，以下列公式計算細胞生長抑制率(Ri):

2 結果與討論

2.1 紫外可見吸收光譜

從實驗部分紫外數據可以看出:(1)自由卟啉的紫外可見光譜有1個Soret帶和4個Q帶。在418 nm處的強吸收是Soret帶，由電子從基態S0躍遷到最低激發單重態S2產生；在500～650 nm之間的吸收帶是Q帶，由電子從基態S0躍遷到最低激發單重態S1產生，這些是卟啉的特征光譜；(2)自由卟啉與Mn2+、Zn2+配位后，Q帶吸收峰由4個減少到2個。這是由于當金屬離子與自由卟啉配位后，形成N-M鍵，配合物的對稱性由D2h變為D4h，且能級靠近，表現為QⅠ、QⅣ譜帶消失，同時Soret帶發生一定程度的位移。紫外光譜的明顯變化說明金屬離子與自由卟啉配位，生成了金屬配合物[13]；(3)與鋅配合物相比，錳配合物的Soret帶紅移至478 nm。分析原因為:2種金屬離子的相對離子半徑順序為Mn2+(88 pm)＞Zn2+(74 pm)， 而電負性 Mn2+(1.5)＜Zn2+(1.6)，因此錳對外層價電子的束縛力較弱，使得電子更易流向卟啉環，從而使卟啉環上的電子云密度升高，降低電子躍遷所需要的能量，使得Soret帶紅移較多[14-15]。

2.2 紅外光譜

根據文獻[16]對3種化合物的紅外特征吸收光譜進行了經驗歸屬，數據見實驗部分。在自由卟啉中，1 637 cm-1處的吸收峰是5-FU中羰基的伸縮振動吸收峰，同時在1 136 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰，這表明5-FU是以成醚的方式與卟啉側端的乙氧鏈相連。而錳配合物、鋅配合物的紅外光譜數據中，分別在1 010和997 cm-1處出現了新的強伸縮振動吸收峰，該峰歸屬于卟啉環內Mn-N鍵和Zn-N鍵的振動吸收，這表明卟啉環內的2個氫原子被金屬取代形成了穩定的金屬卟啉配合物。

2.3 核磁共振氫譜

3種化合物的核磁共振氫譜數據列于合成部分，由數據可知:自由卟啉中環內N-H的化學位移在-2.74處，與卟啉環上苯環相連的2個-CH2的化學位移值分別是4.10～4.12和4.30～4.31，5-FU中的C-H在7.99處出現，而5-FU中的N-H由于沒有處在屏蔽區，故它的δ為正，應在9以上。但由于受溶劑的影響，積分比又小，該峰未顯示出來。再對比鋅配合物的氫譜數據，與鋅離子配位后，吡咯環內NH的化學位移消失，這是形成金屬鋅卟啉配合物的重要證據[17]。

2.4 熒光光譜

卟啉具有典型的雙熒光性質(S2→S0和S1→S0)。通常，S2→S0熒光只有在低溫和極稀的溶液中才能得到，本實驗得到的是S1→S0熒光。圖1只給出了自由卟啉和鋅配合物的熒光發射光譜圖。從圖1可知，自由卟啉的發射峰位于651和715 nm處，與吸收光譜中Q帶成鏡像對稱。而鋅配合物的發射峰出現在599、645 nm處，與自由卟啉相比，熒光特征峰藍移50～60 nm，同時熒光強度減弱，說明鋅配合物具有一定的熒光猝滅性質[17]。這是由于當卟啉環與鋅配位后，吡咯N原子通過σ電子的給予與Zn2+形成配位鍵，同時，Zn2+通過d電子的給予與N原子形成反饋π鍵，由于形成的反饋π鍵可以使卟啉環上的共軛體系的π電子密度增加，從而使熒光特征峰峰位發生改變并產生熒光猝滅效應。而具有順磁性的錳配合物卻觀察不到熒光發射光譜，這是因為順磁性金屬卟啉配合物中π-π*激發單重態與中心金屬的多重態之間發生較強的相互作用，使系間竄躍速率增大，導致最低激發單重態到基態的躍遷幾率降低，產生熒光猝滅[18]。

圖1 化合物L(a)、ZnL(b)的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of compounds L(a)and ZnL(b)

2.5 電化學性質

為了研究金屬離子對卟啉配合物電化學性質的影響，用循環伏安法測試了3種化合物的電化學性質，測定結果及循環伏安曲線分別見表1和圖2。從圖2可以看出，自由卟啉和鋅配合物圖形相似，在負電位區間，均呈現2對準可逆的氧化還原峰，對應于2個單電子還原過程。在正電位區間，自由卟啉呈現1對準可逆的氧化還原峰，而鋅配合物呈現2對準可逆的氧化還原峰。由表1可以看出，化合物L和ZnL的第一氧化峰和第一還原峰的差值分別為2.24和2.14 V，這與通常用來鑒定卟啉環發生氧化還原反應的ΔE1/2=(2.25±0.15)V相一致[19]，也與Zemer等[20]的分子軌道理論計算值2.18 V一致。說明自由卟啉與鋅配合物具有相同的電極反應過程，電子轉移反應在卟啉環上進行，被氧化成π陽離子或還原為π陰離子，并進一步還原為二價陰離子。

表1 化合物L、MnL和ZnL在CH 2Cl2溶劑中的氧化還原電勢數據Table 1 Redox potentials of L,MnL and ZnL in CH 2Cl2 V

圖2 化合物L(a)、MnL(b)和ZnL(c)的循環伏安曲線圖Fig.2 Cyclic voltammograms of compounds L(a),MnL(b)and ZnL(c)

錳配合物MnL的循環伏安曲線形狀與自由卟啉相差很大。基于中心金屬離子先于卟啉環氧化還原的觀點，可認為其第一還原反應發生在金屬Mn上，而其它氧化還原反應發生在卟啉環上[21]。

從表1還可以看出，自由卟啉的第一還原半波電位E1/2為-1.23 V，而錳配合物與鋅配合物的第一還原半波電位E1/2分別變為-1.52和-1.40 V，這是因為卟啉配體與金屬離子配位后對稱性增大，卟啉環更加穩定，還原較難進行，因而需要更高的負電位才能將其還原[22]。

2.6 目標化合物對腫瘤細胞的抑制活性

采用SRB法測定了3個化合物對人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株Bel7402和人結腸癌細胞株HCT-8的抑制活性，結果見表2。從表2可知:(1)樣品濃度為10μg·mL-1時，3個化合物對Bel7402和HCT-8均有一定的抑制作用，而MnL對A549有一定抑制作用，自由卟啉和鋅配合物對A549的抑制率為負值。3個化合物抑制活性均低于陽性對照藥5-氟尿嘧啶，分析原因可能是目標化合物對細胞株的抑制有很強的選擇性，對上述3種細胞株選擇性較差，對其他細胞株的抑制活性將在后續工作中進行。(2)錳配合物對3種細胞株的抑制率明顯高于自由卟啉和鋅配合物，抑制率分別為24.32%、34.16%和23.54%，說明卟啉化合物的抗腫瘤活性與中心金屬離子有關，錳卟啉對癌細胞的抑制活性較鋅卟啉和自由卟啉要高很多，這與文獻[16]所得結論一致。(3)錳配合物對人肺癌細胞株A549的抑制率最高，為34.16%，也表明卟啉化合物的抗腫瘤活性具有一定的選擇性，對不同的腫瘤細胞的作用機理可能不一樣。(4)與文獻[16]對比，發現抑制率均低于文獻值，說明當苯環上連有給電子基時對這3種細胞株的抑制率較大。與腫瘤DNA作用機制可能是:卟啉化合物優先以空間匹配及靜電作用與DNA螺旋小溝中連續的AT(A=腺嘌呤，T=胸腺嘧啶)富堿基區域進行溝槽結合[23]，其抗腫瘤活性與它們和DNA相互作用的強弱、結合模式及中心金屬離子種類均有關。

表2 化合物L、MnL和ZnL對A549、Bel7402和HCT-8的抑制率Table 2 Inhibition rates of L,MnL and ZnL to A549,Bel7402 and HCT-8%

3 結 論

通過親核取代反應合成了5-氟尿嘧啶修飾的自由卟啉L及其金屬配合物MnL和ZnL，采用現代分析測試手段表征了其化學結構。研究了目標化合物的熒光性質和電化學性質；測試了它們的抗癌活性。結果表明:金屬離子對卟啉的熒光性質有顯著影響，鋅配合物熒光強度減弱，而具有順磁性的錳配合物熒光信號消失；錳配合物的循環伏安曲線與自由卟啉、鋅配合物不同，除了卟啉環發生氧化還原外，還發生了金屬離子的氧化還原反應；錳配合物較其他2種化合物有明顯的抗癌作用。

致謝:抑制活性由中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心測試，特此感謝。