山銀花綠原酸提取工藝的優化及不同時期綠原酸的含量

趙佳利，張曉娜，黃 娟，鄧 嬌

(貴州師范大學 蕎麥產業技術研究中心，貴州 貴陽 550001)

山銀花為忍冬科植物紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMip.)、灰氈毛忍冬(L.macranthoidesHand.-Mazz.)、華南忍冬(L.confusaDC.)和黃褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)的干燥花蕾或帶初開的花[1]。山銀花是一種植物類抗生素藥材，是國家重點發展的名貴中藥材，為“銀翹片”中成藥的主要原料。山銀花主要含有綠原酸、三萜類和黃酮類化合物[2]，廣泛作為食用、藥用及化妝、保健品生產原材料，在我國具有很大的市場潛力，故有廣闊的種植前景。作為山銀花主要有效成分的綠原酸，與該植物的藥用價值和臨床療效緊密相關[3]。目前，綠原酸的含量是評價山銀花質量的重要指標，我國藥典明確規定山銀花干燥品綠原酸含量不得低于2%，含灰氈毛忍冬皂普乙和川續斷皂普乙的總量不得低于5%[1]。

山銀花從出花蕾至剛開花的階段可分為幼蕾期、青花期、大白期和銀花期4個階段[4]。山銀花新藤莖頂部1～3位完全伸展葉為幼葉；藤莖中下部為其成熟葉，葉片呈深綠色。

童紅等[5]對山銀花產業現狀調查的結果表明，近幾年全國山銀花的市場需求逐年增加，山銀花生產量和需求量難以平衡，造成供不應求的現象。張永清等[6]研究發現，忍冬各部位以花的綠原酸含量最高，葉的其次；8～9月葉中綠原酸含量最高，同一生長期葉的綠原酸含量約為花的60%～70%。武雪芬等[7]研究發現，越冬老葉的綠原酸含量約為花的1.41倍。葉片作為生產山銀花的副產品，在山銀花種植、修剪過程中可大量得到，但長期以來并未引起足夠重視，造成了極大的資源浪費[8]。綠原酸市場需求量逐年增加，提取綠原酸市場前景廣闊、發展潛力巨大[9]。試驗利用超聲波提取新鮮山銀花的花及葉片綠原酸的含量并了解其動態變化，旨在為山銀花藥材規范化栽培和采收提供理論依據，為合理評價山銀花的質量以及進一步促進山銀花資源的綜合開發利用提供理論基礎，同時也為中藥材山銀花的發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 山銀花 以山銀花處于幼蕾期、青色期、大白期、銀花期的花和幼葉、成熟葉的葉片新鮮樣品為研究對象。該試驗材料于2018年5月中旬采摘于貴州省黔西南布衣族苗族自治州貞豐縣北盤江鎮(東徑105°64′，北緯25°64′)。

注：1，幼蕾期；2，青色期；3，大白期；4，銀花期；5，幼葉；6，成熟葉。

Note:1, young bud stage; 2, cyan period; 3, green-white stage; 4, silver florescence stage；5, young leaf; 6, mature leaf.

圖1 試驗用各時期山銀花新鮮的花和葉

Fig.1 Fresh flowers and leaves ofLoniceraeused in the experiment at various stages

1.1.2 儀器 AR1140電子天平，上海精天電子儀器公司；微量移液器，Eppendorf(德國)；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器設備廠；H-1650R離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；KS-5200DE液晶超聲波器，昆山潔力美超聲儀器有限公司；WH-861渦旋混合器，上海康華生化儀器制造廠。

1.1.3 試劑 綠原酸標準品，純度級別≥98%；無水乙醇，市售；研究過程用水均為超純水，自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 1)樣品采集與處理。試驗材料采摘后立即用液氮速凍，再用研缽研磨成粉末狀，存于-80 ℃冰箱備用。2)綠原酸標準液配制。精密稱取綠原酸標準品10 mg置于10 mL容量瓶，加入無水乙醇溶液定容至10 mL，搖勻得1 mg/mL的綠原酸標準液。使用時用移液器精密吸取1 mg/mL的綠原酸標準液1 mL于試管中，再加無水乙醇至20 mL，搖勻即得0.05 mg/mL的綠原酸標準液。

1.2.2 標準曲線的繪制 分別精密量取0.05 mg/mL的綠原酸標準液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度(10 mL)，依次編號為1～7；以1號試劑溶液做參比，用紫外可見分光光度計于329 nm處測定各濃度綠原酸標準液的吸光度；以吸光度A為縱坐標，以綠原酸濃度C為橫坐標進行線性回歸，計算得到線性回歸方程。

1.2.3 樣品綠原酸的提取 根據劉欣等[10-11]的研究結果，選取影響山銀花中綠原酸提取率的浸提時間、浸提液濃度和料液比等3個因素，以綠原酸提取率為評估價指標，采用L9(34)正交試驗[12]進行綠原酸超聲波浸提正交試驗因素與水平設計(表1和表2)。精確稱取山銀花幼葉粉末共9份各0.5 g，分別放入50 mL離心管中并編號1～9；根據設計方案的料液比用移液器向各離心管中加入相應體積和濃度的乙醇溶液，渦旋混勻后再進行超聲提取，超聲頻率40 kHz，功率100 W，溫度為25 ℃；10 min、20 min和30 min后取出對應編號的離心管，將其放入離心機中，12 000 r/min離心10 min后取上清液至另一新的50 mL離心管中(對應編號)，然后用對應濃度的乙醇溶液定容至相應的體積；將綠原酸提取液放入-4 ℃冰箱中冷藏待用。不同發育時期花和葉中的綠原酸按照正交設計試驗的優化提取方法進行提取，3次重復。吸取綠原酸提取液各0.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，再用各對應濃度的乙醇定容至刻度；然后吸取稀釋后的綠原酸提取液以綠原酸標準溶液做對照，在329 nm處測定吸光度，然后計算各樣品的綠原酸提取率。

表1 山銀花中綠原酸浸提正交試驗設計因素與水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae

水平Level因素 FactorA料液比/(g∶mL)B浸提時間/minC浸提液濃度/%11∶20107521∶30208531∶403095

表2 綠原酸浸提正交試驗的設計方案

Table 2 Design scheme of orthogonal test for extraction of chlorogenic acid

處理 TreatmentABC111121223133421252236231731383219332

1.2.4 最優法提取各樣品的綠原酸 采用正交試驗確定的山銀花浸提最優條件提取不同時期花和葉中的綠原酸，3次重復。采用1.2.3的方法測定吸光度并計算綠原酸的含量。

1.3 數據統計與分析

用Excel 2016進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

2.1.1 綠原酸的標準曲線 從圖2可知，綠原酸濃度在0～0.015 0 mg/mL時，其與吸光度之間存在線性關系，線性回歸方程為y=69.043x-0.015 7(R2=0.998 4)。表明，線性關系良好。

圖2 綠原酸的標準曲線

Fig.2 Standard curve of chlorogenic acid

2.1.2 山銀花綠原酸的浸提效果 L9(34)正交試驗山銀花幼葉綠原酸的提取率依次為0.602%、0.459%、0.274%、0.486%、0.393%、0.641%、0.342%、1.042%和0.721%。由表3和圖3可知，各因素對山銀花中綠原酸提取率的影響程度依次為C>A>B，即浸提液濃度的影響程度最為顯著，浸提時間影響程度最低。隨著料液比增大，提取率逐漸增大，說明，提取液體積增大能促進更多的綠原酸溶出。隨著浸提時間增加，提取率呈先升后降趨勢，原因可能是適當延長超聲提取時間可使細胞結構破碎完全，綠原酸更易溶于提取液中；但處理時間過長則可能使綠原酸結構破壞、分解或使細胞內其他雜質溶出，從而降低綠原酸提取率，與宋琳琳等[13]的結論相近。隨著浸提液濃度增加，提取率隨之降低，可能是溶劑濃度過高使干擾物質溶解，從而影響了提取率，與單磊等[14]的結果類似。根據上述分析可得綠原酸超聲波提取的最優條件為A3B2C1，即料液比1∶40，提取時間20 min，乙醇(浸提液)濃度75 %，在此條件下山銀花幼葉綠原酸提取率為1.042%。

表3 山銀花幼葉綠原酸浸提L9(34)正交試驗的均值與極差

Table 3 Mean value and range of L9(34) orthogonal test for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae%

數據來源 Data sourceABCk10.4450.4770.762k20.5070.6310.555k30.7020.5450.337極差Range0.2570.1550.425

注：表中ki為因素A、B和C的第i(i=1，2，3)水平的提取率。

Note:Thekiin the table is the extraction rate at thei(i= 1,2,3) levels of the factors A, B and C.

圖3 山銀花浸提各影響因素與綠原酸提取率關系

Fig.3 Relationships of extraction rate of chlorogenic acid with factors influencing extraction ofLonicerae

2.2 不同時期花和葉中綠原酸的含量

從圖4看出，幼蕾期、青色期、大白期、銀花期的花和幼葉、成熟葉的綠原酸含量分別為9.074 mg/g鮮重、10.415 mg/g鮮重、2.033 mg/g鮮重、2.252 mg/g鮮重和2.432 mg/g鮮重、8.520 mg/g鮮重。其中，成熟葉、幼蕾期和青色期花中的綠原酸含量均較高且相近，幼葉、大白期和銀花期花的綠原酸含量相近且相對較低，可能是因為幼葉組織尚未成熟，葉綠體合成有機物的量較少，而隨葉片發育有機物合成量增加，從而促進了綠原酸的生成；幼蕾期和青色期的山銀花主要呈綠色，隨花蕾的發育其顏色由綠色轉為白色，在青色期后的發育過程中花蕾中葉綠體和有機物含量減少導致了綠原酸含量銳減。與耿世磊等[15]的研究結論相吻合。

圖4 各時期花與葉的綠原酸含量

Fig.4 Chlorogenic acid content in flowers and leaves at various stages

3 討論與結論

該研究利用正交試驗優化得到山銀花中綠原酸的最佳提取工藝：料液比 1∶40，提取時間20 min，乙醇(浸提液)濃度75%。超聲波能將細胞壁擊碎，使其內容物更易溶入提取液中，從而提高綠原酸的提取率；綠原酸因含有鄰二酚羥基，結構不穩定，高溫及長時間提取可造成綠原酸的分解，因此，要求綠原酸提取過程中溫度不能過高，75%乙醇提取過程中溫度穩定在25℃，可保證綠原酸處于穩定狀態利于提取，從而有效提高綠原酸的提取率且乙醇易回收。該研究結果不僅是該研究的重要前提，使觀測值綠原酸含量接近山銀花中的真實值；也為如何更有效更經濟地提取山銀花中的綠原酸提供了方法，并為有效提高山銀花中綠原酸資源的利用率奠定了基礎。該優化工藝運行成本低，操作簡便易行，對綠原酸類熱敏性物質的提取具有重要意義。

研究結果表明，各時期山銀花平均綠原酸含量為5.944 mg/g FW，各時期葉片平均綠原酸含量為5.476 mg/g FW，山銀花的綠原酸平均含量略高于葉片。山銀花青色期時的綠原酸含量最高，隨著花蕾發育其綠原酸含量呈升高趨勢，至青色期達最高，而后迅速降低，在大白期其綠原酸含量已降至青色期的20%左右，隨后綠原酸含量趨于平穩狀態。成熟葉和幼蕾期山銀花的綠原酸含量接近，幼葉綠原酸含量低于成熟葉并且與銀花期的含量相近。如果入藥過程中只追求藥材的綠原酸含量，理論上應在山銀花的青色期及時進行采收，以期獲得最大的藥用利用價值，并可兼顧山銀花的有效成分和產量。在綠原酸含量方面，山銀花葉和花之間具有相似性，說明，山銀花的葉也極具開發利用價值，在某些方面可以用山銀花的葉代替山銀花。但是，忍冬葉的藥用價值臨床應用較少。吳飛燕[16]對山銀花枝葉進行獸用質量標準研究的結果表明，葉作為藥材的副產物，和原藥材花具有相似的有效成分和藥理作用。從該研究結果可以看出，山銀花的葉在獸藥領域或動物飼料領域存在一定的利用前景，一方面可以緩解山銀花的供需壓力，節約和有效利用山銀花資源，減少動物用藥與人類用藥的沖突；另一方面對山銀花種植戶而言，也是增加種植山銀花收入的一種方式，種植戶積極性提高也可促進山銀花產業的發展。