牛支原體病PCR檢測方法的建立及初步應用

吳位珩， 徐景峨， 余 波*， 張 濤， 余國富， 楊 莉， 馮明祥，孫啟躍， 劉 鏡， 黃 波， 楊茂生， 姜玲玲

(1.貴州省農業科學院 畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005；2.清鎮市動物疫病預防控制中心，貴州 清鎮 551400；3.貴州省關嶺自治縣畜牧服務中心，貴州 關嶺 561300)

牛支原體是危害養牛業的一種主要致病性支原體，除能導致牛肺炎、乳腺炎、關節炎外，還導致眼結膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等多種疾病[1]。1961年，美國人HALE[2]首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到牛支原體，1976年報道其與牛呼吸系統疾病有關。目前，該病原在世界范圍內普遍存在。歐洲每年有25%～33%的犢牛肺炎是由牛支原體引起，相當于每年損失1.44～1.92億歐元，其中英國每年有190萬頭牛患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭。美國每年由牛支原體導致的牛呼吸系統疾病和乳腺疾病所造成損失達1.40億美元，牛場感染率達70%。自2008年以來，我國大部分省(地區)從外地引入肉牛，爆發了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，多數牛在運輸到目的地后1～2周發病，發病率為50%～100%，病死率高達10%～50%，給我國肉牛養殖業造成了巨大的經濟損失[2]。隨著我國肉牛養殖規模的不斷壯大，北牛南運、北繁南育，引進國外種牛日益普遍，肉牛的各種疾病也隨之而來，肉牛支原體病的發生也呈逐年上升趨勢。隨著貴州扶貧攻堅的開展，肉牛引進量不斷增大的同時也帶來了一系列流行病感染問題，而肉牛運輸綜合癥最為突出，項目組2017年1月至2018年6月，對貴州引進肉牛較多的黔西縣、大方縣、水城縣、思南縣等養牛場進行了流行病學調查，發現造成貴州省肉牛運輸綜合癥主要病因是肉牛支原體感染，嚴重的繼發巴氏桿菌感染，從而造成死亡。對此，根據牛支原體OPPD/F基因序列保守區間設計引物，建立了牛支原體PCR診斷方法，結合流行病學調查、臨床癥狀及病原菌分離鑒定，對引進和飼養肉牛發生疾病進行確診，同時制定出有效的預防和治療措施，為飼養肉牛的支原體感染快速確診和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株 牛支原體菌株由華中農業大學動物醫學院惠贈；嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌均由貴州省畜牧獸醫研究所畜禽疫病研究室提供。

1.1.2 引物 根據牛支原體OPPD/F基因序列，應用Primer 5.0基因分析軟件設計引物，擴增片段為226 bp，Genbank上的登錄號為AF130119.1。上引物序列，5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT- 3′；下引物序列，5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′。由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.1.3 生化試劑 Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑盒(試劑條、磁棒套、緩沖液ATL、洗脫液等)、DTT試劑均購自廈門致善生物科技股份有限公司；Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、EDTA、Tris-HcL、瓊脂糖、DL2000 Marker、2×Taq PCR MasterMix(10 mmol/L Tris-HcL、50 mmol/L KCL、1.5 mmol/L MgCl2、0.05 U Poymerase/μL)、去離子水均購自天根生化科技(北京)有限公司；PPLO肉湯培養基、PPLO固體培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；特級馬血清、酵母粉、精氨酸購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、酚紅、瓊脂粉等(國產試劑)。

1.1.4 主要儀器 核酸提取儀購自廈門百維信生物科技有限公司(Lab-Aid 820)，電子天平購自美國奧豪斯(AR2140)，高速冷凍離心機購自美國賽麥飛(SORVALL:LEGEND MICRO 21R)，pH測量儀購自梅特勒-托利多(Delta 320A/c)，梯度PCR擴增儀、電泳儀、紫外透射儀、凝膠成像儀購自德國BIOMETRA，超純水器購自臺灣艾科蒲(ATZ-10-T)，紫外分光光度計購自北京普析(TU-1810SPC)，移液器產自芬蘭，移液頭、PCR離心管產自美國。

1.2 支原體培養基及精氨酸溶液的配制

1.2.1 PPLO液體培養基 稱取葡萄糖2.5 g，PPLO肉湯粉10.5 g，酵母粉2.5 g，溶于445 mL超純水中116℃滅菌20 min后，添加馬血清50 mL，10%精氨酸5 mL，8 萬IU/mL青霉素溶液5 mL，1%酚紅溶液500 μL，置4℃保存備用。

1.2.2 PPLO固體培養基 稱取葡萄糖2.5 g，PPLO肉湯粉10.5 g，酵母粉2.5 g，瓊脂粉7.5 g，溶于440 mL超純水中116℃滅菌20 min后，馬血清50 mL，10%精氨酸10 mL，8 萬IU/mL青霉素溶液5 mL，鋪置平板，凝固后，置4℃保存備用。

1.2.3 10%精氨酸溶液 稱取精氨酸10 g溶于80 mL雙蒸水，攪拌至完全溶解后加水定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾后置4℃保存備用。

1.3 樣本的采集

無菌采集疑似牛支原體肺炎病、死牛肺，或采用棉簽采集疑似牛支原體肺炎鼻涕(鼻拭子)，用冷藏箱帶到實驗室，待培養及提取DNA模板用。

1.4 病原菌的分離培養

將采集的牛肺置于平面皿中，用無菌生理鹽水沖洗，用無菌手術剪刀取中間未污染部分，研磨，致細碎；鼻拭子用1 mL生理鹽水浸潤，盡量將藥棉棒上的鼻涕清洗在試管里，棄去藥棉棒，將處理液0.45 μm濾膜過濾后接種于PPLO肉湯培養基中，5%CO2、37℃恒溫培養48 h以上，培養基由紅變黃，轉接于PPLO固體培養基，5%CO2、37℃恒溫培養72 h，在固體培養基上有針尖大小的菌落，普通光學顯微鏡下可見圓形，邊緣整齊，中央凸起的菌落。

1.5 樣本DNA的提取

1.5.1 組織樣本 DNA 取牛肺少許，采用滅菌手術剪剪碎，加入900 μL生理鹽水，反復凍融3次，然后5 000 r/min離心5 min，取700～900 μL上清液，加入蛋白酶K 20 μL，100 μL 10%SDS液，55℃水浴加熱30 min至組織消化完全，取出冷卻。取1 mL ddH2O將鼻拭子完全浸潤，盡量將鼻涕清洗在試管里，棄去棉棒，將溶液移入1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。將上述處理的組織液200 μL或沉淀放入核酸提取Mini試劑條中，提取的DNA，-20℃保存備用。

1.5.2 分離培養菌株 DNA 取培養菌液1 500 μL于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。按核酸提取Mini試劑盒使用說明書操作進行，提取的DNA，-20℃保存備用。

1.5.3 參考菌株DNA 標準牛支原體菌株、嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌DNA模板的提取，方法同1.5.2。

1.6 牛支原體特異性片段的PCR擴增

1.6.1 反應體系 2×Taq PCR MasterMix為10 μL，支原體標準菌株DNA或樣本DNA 2 μL，上、下引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。

1.6.2 反應條件 94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；最后72℃延伸5 min。取擴增產物5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后送寶生物工程大連有限公司測序。

1.7 PCR反應條件的優化

對PCR反應條件，包括退火溫度(47℃、52℃、67℃)，引物濃度(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)，Taq DNA聚合酶濃度(0.5 U、1 U、2 U)進行優化，以確定最佳反應條件，同時以超純水作為空白對照。PCR反應體系(25 μL)，10×Taq Buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL；Taq DNA 聚合酶1 μL，用超純水補足至25 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度(47℃、52℃、67℃)1 min，72℃延伸90 s，30個循環；最后72℃延伸5 min。72℃延伸1 min，30個循環；最后72℃延伸10 min。取7 μL PCR擴增產物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

1.8 PCR法擴增的特異性及敏感性測定

1.8.1 特異性 分別用標準牛支原體菌株、嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌DNA為模板，進行PCR擴增。

1.8.2 敏感性 采用TU-1800spc紫外可見分光光度計，OD值為260 nm，將牛支原體DNA模板稀釋100倍，進行濃度的測量。根據模板濃度(μg/μL)=A260×稀釋倍數×50/1000的方法進行計算。在進行敏感性試驗時，按10倍稀釋法對DNA模板進行稀釋后，取2 μL模板進行擴增，牛支原體標準DNA濃度依次為1 μg/μL、1×10-1μg/μL、1×10-2μg/μL、1×10-3μg/μL、1×10-4μg/μL、1×10-5μg/μL、1×10-6μg/μL、1×10-7μg/μL。

1.9 臨床樣品的檢測

對2017-2018年黔西縣、大方縣、水城縣、思南縣等養牛場采集121份樣品進行檢測，分離培養病原菌。

2 結果與分析

2.1 PCR產物的鑒定

牛肺炎支原體PCR擴增片段經膠回收、測序得到片段226 bp，與預測結果一致。表明，擴增片段為牛肺炎支原體的特異性條帶。

2.2 PCR反應條件的優化

在25 μL反應體系中，最佳反應條件：退火溫度52℃，Taq DNA聚合酶10 μL，引物濃度20 μmol/L，采用上述條件擴增出了目的片段，片段大小為226 bp(圖1)，無非特異性片段產生。

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2，標準陽性；3，被檢出的陽性樣本。

Note:M,Marker DL2000; 1，negative control; 2，standard positive; 3,positive samples detected.

圖1 牛支原體 PCR反應圖譜

Fig.1 Map ofM.bovinaPCR reaction

2.3 特異性及敏感性

2.3.1 特異性 由圖2可見，除牛支原體出現擴增帶外，其他的菌株未見特異性226 bp片段，表明引物具有特異性。

注：M，Marker DL2000；1，標準陽性；2，陰性對照；3，嗜血桿菌；4，魏氏梭菌；5，大腸桿菌；6，多殺性巴氏桿菌；7，沙門氏菌；8，牛結核分枝桿菌。

Note:M,Marker DL2000; 1,standard positive; 2,negative control; 3.Haemophilusinfluenza; 4,Clostridiumwilfordii; 5,Escherichiacoli; 6,Pasteurellamultocida; 7,Salmonella; 8,M.bovina.

圖2 牛支原體PCR特異性試驗圖譜

Fig.2 Map of the PCR specificity test ofM.bovina

2.3.2 敏感性 經測牛支原體標準DNA模板的平均OD260值為0.633 nm，試驗提取的牛支原體標準DNA模板的含量為0.5 μg/μL。由圖3可見，在PCR反應中，可檢出的牛支原體標準DNA模板的含量最小是1×10-7μg，即靈敏度為1×10-7μg。

2.4 臨床樣品的檢測

經檢測共得陽性樣本43份，且與細菌學檢驗結果一致，同時將PCR擴增片段經膠回收、測序表明，擴增片段為牛支原體的特異性條帶(圖4)。整個檢測過程僅需3.5 h。

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2～8，牛支原體 DNA稀釋度分別為10-1～10-7。

Note:M,Marker DL2000; 1,Negative control; 2-8,the dilution ofM.bovinaDNA was 10-1-10-7,respectively.

圖3 牛支原體PCR敏感性試驗圖譜

Fig.3 Map of the PCR sensitivity test ofM.bovina

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2，標準陽性；3～22，臨床樣本鼻拭子。

Note:M,Marker DL2000; 1,negative control; 2,standard positive; 3-22,nasal swabs from clinical samples.

圖4 臨床樣本的檢測圖譜

Fig.4 Test Map of clinical samples

3 結論與討論

目前，用于牛支原體診斷方法很多，如分離培養法、免疫學方法和核酸診斷技術等[3]。在標本中分離培養支原體，對于牛支原體感染的診斷有決定性意義，結合生化鑒定技術，可作為實驗室診斷牛支原體感染的基本診斷技術，但不能作為確定感染的最終檢測方法和結果。而大多數的肉牛支原體病伴有多病原混合感染，臨床上難以及時鑒別診斷，細菌學培養分離鑒定，程序繁瑣、培養周期長，免疫學診斷雖操作簡單，但具有抗體依耐性，特別是在感染早期，血清中抗體水平低，檢測的敏感性低，達不到早期診斷的目的，延誤防治時機，給肉牛業造成巨大的經濟損失。而PCR診斷技術具有敏感、特異的特點，能快速、準確地檢測病原核酸，且不考慮菌體死活、抗體產生等因素，并可對疾病早期進行診斷，為防治該病爭取到最佳的治療時機。因此，核酸診斷技術是牛支原體感染較為理想的診斷方法。ATP結合蛋白OPPD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因為目標基因的PCR，已證實能夠較好地區別牛支原體與牛無乳支原體的感染[4]。本試驗根據牛支原體OPPD/F基因序列保守區間設計引物，通過優化反應條件，建立了牛支原體PCR診斷方法，靈敏度為1×10-7μg，整個檢測過程僅需3.5 h。由此可見，該檢測方法具有快速、靈敏性高、特異性強等特點，對牛支原體感染的診斷、防治與預后評估具有重要意義。

經調查，貴州省肉牛運輸綜合癥主要病因是肉牛支原體感染，肉牛支原體感染的治療方法：肌肉注射治療支原體病的特效藥泰樂菌素，同時補充多種維生素及10%葡萄糖。若出現混合感染多種病原現象，治療時采用四環素、慶大霉素、地塞米松合并用藥，同時補充10%葡萄糖和維生素C，用藥5～7 d。

引進和飼養肉牛應注意的事項：

1)嚴格引進新牛。不從疫區或發病區引進牛。牛群引進前要作好牛布魯氏病、口蹄疫、牛結核、牛支原體、牛焦蟲病的檢疫檢測，防止引進病牛和潛伏感染期的帶菌牛。牛群起運前，要飼喂適量的水、料、草，適宜控制在八成飽，裝車前運輸車輛及上車臺等用具進行消毒，裝車避免擁擠，運輸要勻速。到達目的地后必須進行充分休息，之后方可喂水(飼喂水清潔干凈，加入電解多維和食鹽，可適量補充葡萄糖)，接著飼喂足夠的青綠飼草。對牛場新進來的牛進行監控和隔離，包括犢牛都必須隔離，確保無病后方可與健康牛混群。

2)加強飼養管理。保證良好的衛生環境非常重要，牛舍保持干燥、清潔、通風良好，注意防寒保暖，定期對肉牛場的設施設備進行清潔。定期進行消毒，控制飼養密度適宜，防止過于擁擠。不同來源以及不同年齡的肉牛要采取分欄飼養。飼喂品質優良的飼料，補充適量的精料、微量元素和維生素，確保日糧含有全面、均衡的營養，增強機體抵抗力。

3)加強疾病預防。定期消毒牛舍，及時發現和隔離病牛，做到早診斷，早治療，同時研制并開發獸用中藥防控該病的發生和流行，以確保貴州省養牛業的健康和穩定發展。