基于雙光路熒光強度法的水體葉綠素a原位傳感器設計*

史 正,胡映天,劉 超,王曉萍

(1.浙江大學現代光學儀器國家重點實驗室,浙江大學光電科學與工程學院,杭州 310027;2.浙江省海洋觀測-成像試驗區重點實驗室,浙江大學海洋學院,浙江 舟山 316021)

海洋是地球上十分珍貴的資源寶庫,近些年,我國海洋水產業得到了迅猛的發展,海洋魚類、蝦類、貝類、海珍品等水產品快速拉動了沿海經濟的發展[1]。然而隨著海洋水產業的發展,過度捕撈、環境污染、廢水隨意排放等問題日益嚴重,直接導致了海洋漁業資源的衰退以及近海環境的破壞,對海洋環境以及水產業的長期發展十分不利[2],為了維持海洋資源的可持續發展,使海洋可以源源不斷地造福人類,海洋牧場成為解決這一問題的有效途徑[3]。近年來,隨著研究的深入以及國家政策的支持,海洋牧場不斷興起,大大提升了沿海地區養殖業經濟的發展,使得持續向海洋要糧食成為可能[4]。海洋牧場的水體環境和質量,是影響其正常運營和收益的重要指標和因素,主要關注的水質指標包括溫度、鹽度、pH、葉綠素a濃度等[5],其中葉綠素a是浮游植物中最重要的色素,其濃度代表著浮游植物的含量[6],同時也是海水富營養化程度的重要評測參數之一。浮游植物含量過少會導致海水營養不足,難以維持生物群落生存的需求;而浮游植物含量過多會導致大量浮游植物死亡腐爛,腐爛過程中的有氧細菌會大量消耗海水中的氧氣,不利于生物群落的生存。因此對海洋牧場中葉綠素a濃度的實時在線監測,有助于及時掌握牧場區海洋生態環境的變化特征和規律,維持海洋牧場的正常運營。

目前基于熒光法的水體葉綠素a傳感器已經取得了一定研究進展。Jacob J Lamb等人設計了一款葉綠素熒光傳感器[7],使用435 nm、470 nm和457 nm三種LED分別作為葉綠素a溶液、葉綠素b溶液和葉綠素a、b混合溶液的熒光激發光源,使用集成有前置放大器的光電二極管作為探測器,傳感器的動態范圍為0～5 μmol/L。Rao Govind等人設計了一款葉綠素和濁度傳感系統[8],使用470 nm大功率LED和三色 LED(470 nm,525 nm,660 nm)作為光源,分別用于熒光檢測和吸光度檢測,并使用溫度傳感器對系統進行溫度補償。Lior Blockstein等人設計了一款無透鏡便攜式葉綠素a傳感器[9],使用465 nm LED作為光源,使用CMOS作為探測器,并使用鍍有BBY涂層的相機鏡片作為長通濾光片,通過在FPGA平臺上運行圖像處理算法測算葉綠素a的濃度,傳感器的動態范圍為0～1 μmol/L。殷高方等設計了一款基于熒光動力學的可調諧脈沖誘導熒光傳感器[10],使用465 nm LED陣列作為激發光源,使用光電倍增管作為探測器,通過快速強脈沖光和慢速弱脈沖光檢測葉綠素a熒光誘導過程的中間參數,反演出電子轉化速率,進而對光合作用反應速率進行測量。

雖然對葉綠素a原位傳感器的研究已有一些成果,但它們普遍沒有考慮光源波動和光源衰減對測量結果的不利影響,使得傳感器的測量誤差隨傳感器的使用逐漸變大,需要經常校準維護。針對這些問題,本文設計了一款基于雙光路熒光強度法的葉綠素a原位傳感器,使用參考光路補償光源變化對測量結果的影響,提高傳感器的測量準確度和連續工作壽命,降低維護成本。使用LED和光電二極管作為光源和探測器減小傳感器的體積,使用鎖相放大電路提高傳感器的抗干擾能力和測量準確度,并通過設計低功耗模式減小傳感器的平均功耗。

1 傳感器設計原理

1.1 葉綠素a熒光檢測原理

熒光分析法根據物質的熒光特性,不僅可以定性地分析物質組成,還可以定量地分析物質的含量,具有特異性強、靈敏度高、響應速度快等優點。水體中葉綠素a的熒光強度特性滿足朗伯-比爾吸收定律,當激發光入射到水體時,葉綠素a產生的熒光強度為

If=φI0(1-10-εbc)

(1)

式中:I0為入射光光強,If為熒光光強,c為水體中葉綠素a的濃度,b為入射光在水體中的光程,ε為吸光系數,φ為葉綠素a的熒光效率。對式(1)中的指數項使用泰勒公式展開成多項式,當水體中葉綠素a的濃度和吸光度滿足εbc<0.05時,多項式中的高次項可以忽略,此時葉綠素a的熒光強度為

If=2.3φI0εbc

(2)

由式(2)可知當入射光光強、吸光系數和光程確定時,葉綠素a溶液產生的熒光光強If與葉綠素a的濃度c成線性關系。

圖1 葉綠素a的吸收光譜和發射光譜

當溶劑為甲醇時,葉綠素a的吸收光譜和激發波長為417 nm時的發射光譜如圖1所示(數據來源自OMLC)。由圖1可知,葉綠素a在藍光波段的417 nm和紅光波段的660 nm處存在吸收峰,并且對藍光波段的吸光度遠大于對紅光波段的吸光度;葉綠素a在紅光波段的671 nm和720 nm處存在發射峰,并且671 nm處發射峰的強度遠大于720 nm處發射峰的強度。

為了使傳感器具有最佳的靈敏度,并考慮實際器件的選型,本文使用中心波長為430 nm的LED作為葉綠素a熒光的激發光源,使用光電二極管測量葉綠素a在680 nm處的熒光強度。由圖1可知當激發波長為430 nm時,葉綠素a的摩爾吸光系數為47 221 cm-1·M-1,而葉綠素a的摩爾質量為893.51 g/mol,當光程為1 cm時,為了滿足式(2)的成立條件(εbc<0.05),葉綠素a傳感器的檢測上限應小于943 μg/L。為了適應海洋牧場的實際需求,本文設計的傳感器檢測上限為200 μg/L。

1.2 鎖相放大電路原理

雖然干涉濾光片可以濾除大部分背景光,但是背景光中與熒光波長接近的光會透過濾光片進入光電二極管,使得測量結果與真實值出現偏差,因此本文使用鎖相放大電路作為熒光信號的放大電路。鎖相放大是微弱信號檢測領域中十分常用的方法,它可以有效地從噪聲中分離出有效信號[11]。其原理是使用正弦波或方波對激發光源進行調制,在測量系統的響應時,使用與被測量信號同頻同相的參考信號對系統的響應信號進行解調。因此,鎖相放大電路具有很窄的通頻帶和很高的品質因數。鎖相放大電路的結構框圖如圖2所示,主要的電路包括帶通濾波器、低通濾波器、乘法器和移相器。

圖2 鎖相放大電路框圖

假設輸入信號經過帶通濾波器后的信號A為

x(t)=β1V0cos(ω0t+θ)

(3)

式中:β1為帶通濾波器的增益,V0為信號的振幅,ω0為調制頻率,θ為相位。如果參考信號B使用占空比為0.5的方波,它可以用級數表示為

(4)

若低通濾波器的增益為β2,則信號A和信號B經過乘法器和低通濾波器后的輸出信號為

(5)

由式(5)分析可知鎖相放大電路的輸出與原始信號的振幅以及信號A與信號B之間相位差的余弦成正比,當相位差為0時,鎖相放大電路的輸出最大。由于噪聲與參考信號同頻同相的概率很小,因此鎖相放大電路具有很好的抗噪聲能力。在實際設計中,為了簡化系統,常常使用方波代替正弦波對光源進行調制。

2 傳感器硬件設計

2.1 雙光路熒光強度法檢測光路設計

在實際環境中,LED的發光強度容易受到溫度、驅動電流波動以及自身老化等因素的影響,造成傳感器的測量結果出現誤差。為了解決這一問題,本文設計的傳感器具有一路參考光路,根據熒光和參考光之間的關系消除光源變化對測量結果的影響。Wang[12]等人使用兩個LED分別作為參考光路和熒光檢測光路的光源,但兩個LED間的參數誤差難以保證補償的有效性。為了保證補償的效果并控制傳感器的體積,傳感器的兩個光路共用同一LED作為光源,并使用LED反射出的一部分光作為參考光。雙光路熒光強度法檢測光路如圖3所示。

圖3 雙光路熒光強度法檢測光路圖

傳感器的光路分為兩路:熒光檢測光路和參考光路,所用到的光學器件有:藍色LED、石英窗口、干涉濾光片、凸透鏡和光電二極管。為了減小入射光對測量結果的影響,熒光檢測光路垂直于光源的方向。本文選用樹脂封裝的430 nm高亮LED(epitex L430R-06)作為激發光源,它的發射角僅為±4°,帶寬為20 nm,既可以避免光源端聚光透鏡的使用,減小傳感器的體積,又可以避免其他具有熒光特性的物質對測量結果造成干擾。進入熒光檢測光路的光包括葉綠素a的熒光和環境光、背景光等干擾光,為了從復雜環境中提取葉綠素a熒光,本文使用中心波長為680 nm的高性能干涉濾光片(Thorlabs,FB680-10)對接收到的熒光進行濾光,只允許葉綠素a的熒光通過濾光片。為了提高熒光的接收效率,本文使用平凸透鏡(Daheng Optics,Φ12.7,F12.7)對接收光線進行會聚,提高檢測的靈敏度。為了控制傳感器的尺寸并降低功耗,本文使用高靈敏度的光電二極管(Hamamatsu,S2386-5K)作為熒光和參考光的探測器。

假設LED發出的光強為I0,用于激發葉綠素a熒光的光強為αfI0,進入參考光路的光強為αrI0,αf和αr之間滿足αf+αr<1。令If為熒光檢測光路中光電二極管接收到的光強,根據式(2)可得

If=2.3αfφI0εbc

(6)

令Ir為參考光路中光電二極管接收到的光強,則有

Ir=αrI0

(7)

聯立式(6)、式(7)可得

(8)

當傳感器的機械結構固定后,比例系數αf,αr和光程b將固定不變,若葉綠素a溶液滿足εbc<0.05,則兩路光強的比值與葉綠素a的濃度之間成線性關系,并且測量結果不受光源變化的影響。

2.2 電路結構設計

本文所設計的傳感器的電路框圖如圖4所示。主要的電路有電源電路、MCU電路、RS485電路、LED恒流驅動電路、I/V轉換電路和鎖相放大電路。

圖4 系統電路框圖

本文選用STM32F103作為系統的主控芯片,它強大的PWM和ADC功能可以實現對LED驅動電路的調制和對鎖相放大電路的控制,同時它支持低功耗模式,可以在傳感器測量間隙進入停止模式降低系統功耗。LED使用線性恒流驅動芯片(DIODES,AL5812)進行驅動,并通過外接MOS管實現方波調制。傳感器工作時,熒光檢測光路和參考光路的光電二極管將熒光信號和參考光信號轉化為電流信號,并通過I/V轉換電路將電流信號轉化為電壓信號。使用模擬開關芯片(TI,TS5A3154)對兩路電壓信號進行分時選通,以降低傳感器的體積與成本。使用STM32的ADC對鎖相放大電路中帶通濾波器的輸出信號進行定時采樣,使用定時器記錄信號波峰與LED驅動信號上升沿之間的時間差,并根據時間差調整參考信號的相位,保證鎖相放大電路的相位鎖定。隨后使用鎖相放大電路(ADI,AD630)對模擬開關芯片的輸出信號進行鎖相放大,濾除干擾光對測量結果的影響。最后使用24位Σ-Δ 型ADC(CHIPSEA,CS1237)將鎖相放大電路的輸出信號轉化為MCU可處理的數字信號。傳感器系統通過485接口實現與上位機的通信,可以同時滿足傳感器長距離工作以及組網工作的要求。

為了滿足長時間水下工作的需求,傳感器使用3.7 V鋰電池(18650電芯)進行供電。傳感器的電源系統如圖5所示。由于傳感器所需的供電電平較多(3.3 V、±5 V和6 V),并且為了保證電源網絡的純凈與低噪聲,電源系統采用開關電源+LDO的組合架構,通過開關電源將鋰電池的輸出電壓變換至±6 V,再通過LDO產生各個電路模塊所需要的電平。為了避免數字電路的噪聲對模擬電路的測量結果造成干擾,兩部分采用單獨的供電網絡進行供電。在模擬電源網絡入口端放置一個由MCU控制的使能開關(MOS管),通過在傳感器測量間隙關閉模擬電路的供電,降低傳感器的功耗。

圖5 電源系統結構圖

當鎖相放大電路的輸入信號與參考信號間的相位差為0時,設熒光檢測光路和參考光路的信號經ADC轉換后的數字信號分別為Df和Dr,根據式(8)可得數字信號與葉綠素a濃度之間的關系為

(9)

2.3 傳感器實物圖

為了方便傳感器的安裝與投放,傳感器的外形采用圓柱體設計,長度為137.5 mm,直徑為61 mm。傳感器的實物如圖6所示。

圖6 傳感器實物圖

3 實驗與結果分析

葉綠素a的標準溶液使用實驗室研磨的方法從植物葉片中提取[13]。取新鮮樹葉1 g,用無水乙醇將葉片清洗干凈,去除脈絡后剪碎,放入研缽中。加入少量碳酸鈣(防止葉綠素a分解)、石英砂(加速研磨)和5 mL乙醇(95%)研磨5 min,將研磨后的漿體放入5 mL離心管中,使用離心機以4 000 r/min的速度離心2 min,將上清液倒入25 mL的棕色容量瓶中,加入乙醇(95%)定容。取3 mL標準液放入 1 cm 的比色皿中,使用分光光度計分別測量溶液在645 nm和663 nm處的吸光度,隨后使用Arnon公式計算標準葉綠素a溶液的濃度為[14]

c=12.7A663-2.69A645

(10)

式中:A645和A663分別為溶液在645 nm和663 nm處的吸光度,濃度的單位為mg/L.因為葉綠素a見光易分解,標準溶液在配制完成后應立即使用,若需要保存標準溶液,應將其放置在溫度低于4 ℃的冰箱中[15],保存時間應小于24 h。

所設計的傳感器的動態范圍為0～200 μg/L,為了測試傳感器在動態范圍內的響應,使用標準溶液配成6種不同濃度的葉綠素a溶液(10μg/L,40 μg/L,80 μg/L,120 μg/L,160 μg/L和 200 μg/L)。依次取6種不同濃度的葉綠素a溶液150 mL放入500 mL的燒杯中,隨后將傳感器投入到溶液中,分別測試在不同濃度時傳感器的輸出?？紤]到傳感器的輸出與葉綠素a濃度之間的線性關系,本文對測試結果進行線性擬合。測試結果如圖7所示,圖中的矩形點為傳感器的真實輸出值,虛線是葉綠素a濃度和傳感器輸出之間的線性擬合。

圖7 傳感器響應測試結果

由圖7可知,傳感器輸出和葉綠素a濃度之間的關系為

c=111.44R-19.134

(11)

式中:c為葉綠素a的濃度,R為傳感器的輸出,即熒光通道采樣結果與參考通道采樣結果的比值。擬合相關系數r2=0.998,說明傳感器輸出在動態范圍內具有很好的線性。

為了測試傳感器在動態范圍內的測量準確度,使用標準溶液配成另外6種不同濃度的葉綠素a溶液(5 μg/L,20 μg/L,60 μg/L,100 μg/L,140 μg/L和180 μg/L),依次取6種不同濃度的葉綠素a溶液150 mL放入500 mL的燒杯中,隨后將傳感器投入到溶液中,分別測試在不同濃度時傳感器的輸出,然后利用式(11)計算出葉綠素a濃度的測量值。測試結果如表1所示。

表1 傳感器測量準確度測試結果

由表中的測試結果可知傳感器在動態范圍內的測量誤差在±2 μg/L以內,表明傳感器具有良好的測量準確度。

使用純凈水測試傳感器的噪聲水平。將傳感器投入到純凈水中,每隔1 min獲取一次傳感器的輸出,連續測量40次,測試結果如圖8所示。通過分析可知40次測量結果的均方根誤差為0.000 44,而傳感器的滿量程輸出范圍為1.8,則傳感器的信噪比SNR=4072,表明傳感器具有很好的噪聲水平。若以2倍信噪比表示傳感器的最小分辨能力,則傳感器的分辨率為0.1 μg/L。

圖8 傳感器噪聲測試結果

為了驗證傳感器在真實水樣下的可靠性,將海洋綠藻溶液稀釋成某一較低的濃度,并取150 mL稀釋后的溶液放入500 mL的燒杯中,隨后將傳感器投入到溶液中,每隔30 min獲取一次傳感器的輸出,連續測量80次。作為對比,在每次測量之后,立即采集與傳感器光源同高度的水樣1 mL放入熒光光譜儀(HITACHI,F4600)中,設定激發波長為430 nm,接收波長為680 nm,測量此條件下溶液的熒光強度。由于在靜止溶液中綠藻會逐漸下沉,因此每測量20次之后對溶液進行攪拌。測試結果如圖9所示,圖9中的矩形實線為傳感器的輸出值,圓形虛線為熒光光譜儀測得的溶液熒光強度。

圖9 對比試驗結果

由圖9可知在每次攪拌后,由于綠藻的自然下沉現象,葉綠素a濃度測量結果的趨勢為先增大,后逐漸減小。通過分析可知傳感器輸出與光譜儀讀數之間的相關系數為0.94,表明傳感器的測量結果具有良好的可靠性。

由于傳感器需要在水下長時間在線監測,因此它的功耗直接影響了連續工作的時間。本文設計的傳感器在測量間隙自動進入低功耗模式,為了測試傳感器可連續工作的時長,分別測試在低功耗模式和正常測量時的電流消耗,測試結果如表2所示。

表2 傳感器功耗測試結果

在真實工作環境中,每次葉綠素a濃度測量需要耗時8 s,而每30 min測量一次即可滿足實時監測的要求,此時傳感器一個月消耗的電能約為921 mAh。傳感器使用的鋰電池容量為5 600 mAh,若電池每個月自然損耗5%的電量[16],則傳感器可以連續工作5個月以上。

在實際環境中,由于傳感器使用熒光強度與參考光強度的比值代表水體中葉綠素a的含量,因此傳感器的輸出會受到海水濁度、藻的種類以及其他共存物等因素的影響。對于濁度,由于懸浮顆粒的反射作用,會使得傳感器接收到的熒光強度增大,當水體濁度很大時,影響較為明顯。若要在渾濁的水體中測量葉綠素a濃度,需要結合濁度傳感器對葉綠素a傳感器的測量結果進行修正。對于不同的藻類,即使其葉綠素a含量相同,其產生的熒光強度也不盡相同,需要使用被測區域的水樣,通過實驗室提取葉綠素的方法對傳感器進行標定,以提高檢測的準確度。雖然LED和濾光片的帶寬都很窄,但是其他與葉綠素a熒光特性類似的物質(如熒光素、羅丹明等)會對傳感器的測量結果造成一定影響,但是實際水體中含有這些物質的概率較小,對傳感器的影響有限,使得葉綠素a傳感器可以應用于大多數場景。

4 結語

本文設計了一款基于雙光路熒光分析法的葉綠素a原位傳感器,使用中心波長為430 nm的小發射角LED作為熒光激發光源,可以高效地激發葉綠素a熒光,通過參考光路補償光源變化對測量結果的影響,提高傳感器的測量準確度和連續工作壽命,降低維護成本。使用高靈敏度的光電二極管作為熒光和參考光的探測器,可以在保證測量準確度的前提下縮小傳感器的尺寸。通過鎖相放大電路對熒光信號進行放大,可以有效地避免噪聲和背景光對測試結果的影響,通過設計低功耗工作模式降低傳感器的平均功耗,提高傳感器連續測量的時間。使用標準溶液配制成不同濃度的葉綠素a溶液對傳感器進行測試,測試結果表明傳感器在動態范圍內具有良好性能;將傳感器的測量結果與熒光光譜儀的測量結果進行對比測試,實驗結果表明傳感器具有良好的可靠性,滿足海洋牧場對與葉綠素a濃度在線監測的需求。