黑雞心葡萄酵素體外抗氧化性能研究

郭艷萍， 盧圣玉， 許志國， 曹 娜， 孫鵬杰， 侯 健

(太原工業學院環境與安全工程系，山西 太原 030008)

引 言

葡萄酵素是以葡萄為原料，經過多菌種復合型微生物群體發酵制得的可食用的液態發酵產品[1]。研究表明，天然酵素因其含有豐富的有機酸、功效酶、維生素和礦物質而具有較強的抗氧化性能[2]，可美容養顏、抑菌消炎、提高免疫力[3]。黑雞心葡萄是山西特有葡萄品種之一[4]，色澤黑紫，果粒密實，形似雞心，但其口感偏澀，種植率大幅度降低，需改變其食用方式，達到保種目的，制成酵素后口感改善，種植率緩慢提升。

本研究對天然發酵生產的黑雞心葡萄酵素的總酚含量、還原力、DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧自由基清除率進行了測定,旨在為黑雞心葡萄天然酵素的生產工藝改良提供一定的理論依據和數據支持。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

pH儀、電子天平、752N型紫外可見分光光度計、TGL-16G-C高速冷凍離心機、SW-C1-IPD-Z型潔凈工作臺、電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵素的制備[5]

冰糖紫外殺菌30 min，與葡萄按質量比1∶1加入到已滅菌的玻璃瓶中，封口，常溫下發酵。發酵過程中，每6 d為一階段取樣，樣品10 000 r/min離心10 min后，用于測定。

1.2.2 總酚含量測定[6]

以沒食子酸等價物表示，按照標準曲線線性方程y=0.092 0x+0.020 8，R2=0.999 9測定總酚含量，y為吸光度，x為樣品濃度(GAE,μg)。樣品100 μL、去離子水45.9 mL，Folin-Ciocalteau試劑1 mL，反應5 min，最后，加入20%的Na2CO3溶液3 mL，以去離子水為參比于760 nm波長下測吸光度。

1.2.3 DPPH·清除率

40 μL酵素樣品加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液中，再加Tris-Hcl buffer(50 mmol/L,pH=7.4)450 μL，25 ℃振蕩混勻后于517 nm波長下測吸光度。

1.2.4 ABTS自由基清除能力[7]

10 μL酵素樣品加入到5 mL ABTS母液中，30 ℃水浴5 min后于734 nm下測定吸光度。

1.2.5 ·OH清除能力

水楊酸法[7]：酵素樣品135 μL加入到1.4 mL H2O2(6 mmol/L)，再加入2 mL硫酸亞鐵(1.5 mmol/L)和0.6 mL水楊酸鈉(20 mmol/L)，25 ℃水浴1 h后于562 nm下測定吸光度，其清除率計算見式(1)。

清除率(%)=[1-(A562-Ai)/Ac]×100

(1)

式中：Ac為空白對照的吸光度值。

鄰苯三酚法[8]反應體系：50 μL樣品、950 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)，1 mL NADH、1 mL NBT、1 mL PMS。25 ℃恒溫反應5 min后于560 nm下測吸光度。

1.2.7 還原力測定

普魯士藍法[9]。反應體系：30 μL樣品，2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.6)，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃反應30 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。700 nm下測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 葡萄酵素總酚含量的測定

由圖1可看出，葡萄酵素在發酵初期0 d～12 d總酚含量緩慢上升，12 d～18 d含量有較大降幅，之后，總酚含量呈逐步上升趨勢，至36 d總酚含量達到最大值2.850 mg/mL，之后趨于平穩。酚類物質含量隨著發酵過程中有益生菌的增加而增多，當菌群達到穩定期時酚類物質溶出速率平穩。

圖1 發酵過程中總酚含量的變化

2.2 葡萄酵素對DPPH·清除能力

由圖2可看出，葡萄酵素對DPPH·的清除能力展示出與發酵過程中總酚含量(圖1)變化趨勢一致，但變化幅度較小。清除能力總體較強，峰值出現在第30 d，清除率達到93.25%，較初始增加了6.80%。葡萄酵素對自由基的清除率主要原于發酵過程中酚類物質的溶出，展現出較強的抗氧化活性。

圖2 發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

2.3 葡萄酵素對超氧自由基清除能力

圖3 發酵過程中超氧自由基清除能力的變化

2.4 葡萄酵素對羥基自由基(·OH)清除能力

·OH是生物體內最活潑的自由基，毒性強、高損傷性，可損傷細胞膜，輕易地進入各種細胞中，導致疾病發生。

圖4顯示，葡萄酵素對·OH的清除能力相對于其他自由基的清除能力較低，比未發酵時增加了4.13%。發酵初期，葡萄酵素對·OH的清除能力呈大幅減弱，之后緩慢回升，在42 d時達到62.16%。

圖4 發酵過程中羥基自由基清除能力的變化

2.5 葡萄酵素對ABTS自由基清除能力

圖5顯示，發酵過程中葡萄酵素對ABTS自由基的清除能力呈小幅波浪形變化，但整體清除率較高，發酵30 d時出現最大值88.20%，增幅13%左右。

圖5 發酵過程中ABTS自由基清除能力的變化

2.6 葡萄酵素發酵過程中還原力的變化

第3頁圖6顯示，葡萄酵素在發酵過程中還原力變化波動較大，初期持續上升而后驟降，24 d達到最低值后緩慢回升。18 d時達到峰值，發酵前、后還原力增加了80.41%。總體呈上升趨勢，說明酵素在發酵過程中抗氧化成分是有所增加的。

3 結論

研究結果表明，以山西黑雞心葡萄為原料，經過多種微生物復合發酵制得的黑雞心葡萄酵素抗氧化性能較強，發酵生產30 d的酵素抗氧化能力最強。發酵過程中自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢，發酵

圖6 發酵過程中還原力的變化

前、后分別提高了6.84%和6.80%、4.13%和13%。還原力變化雖不規則，但總體呈上升趨勢。研究發現，黑雞心葡萄天然酵素對4種自由基的清除能力與總酚含量的變化呈相同趨勢，具有一定相關性。本研究結果為黑雞心葡萄酵素的工藝改良提供一定的理論依據和數據支持。