腦轉移癌患者免疫組化與電鏡特征及局部血腦屏障變化的臨床意義

汪 逵 鄧民強 魏 文 周 晗 李元紅

腦轉移癌又稱顱內轉移瘤，指原發于機體其他部位的腫瘤轉移至顱內，顱內腫瘤中有3.5%～10%為腦轉移瘤，惡性腫瘤患者中有25%～35%在其患病過程中出現腦轉移癥[1-2]。腦轉移瘤可隨時在患者患原發腫瘤的過程中表現出體征和癥狀，病程較短，病情在發病后呈進行性加重。血腦屏障可以阻止血液中的有害物質進入腦組織[3]，對腦組織內環境的穩定起到至關重要的作用，對中樞神經系統維持正常的狀態具有十分重要的意義。研究表明轉移的癌組織能夠表達大量的血管內皮細胞生長因子，達到形成新生血管組織的目的，但是新生的血管組織因缺乏血腦屏障而會引起血漿成分滲漏[4-5]。腦原發腫瘤與腦轉移瘤對于治療呈現不同的反應，在腦轉移癌的治療中，水溶性藥物可取得與患者原發病灶幾乎相似的療效。本研究通過對腦轉移癌患者電鏡特征和免疫組化的探討，來闡明其局部血腦屏障變化的臨床意義。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 免疫組化標本 選取2014年12月至2017年12月在本院接受治療的16例腦轉移癌患者的標本蠟塊，肺癌為原發病14例，其病理類型為：1例腺鱗癌，7例小細胞癌，2例鱗癌，4例腺癌；肝細胞癌為原發病1例；乳腺浸潤性導管癌1例。隨機選取16例同時期在本院接受治療的腦膠質瘤患者術后標本蠟塊作為對照，其病理分級為：4例Ⅰ～Ⅱ級，10例Ⅱ～Ⅲ級，2例為多形性膠質母細胞瘤(Ⅳ級)。

1.1.2 電鏡標本 選取2014年12月至2017年12月在本院神經外科接受治療進行腦腫瘤手術切除的患者新鮮標本共6例，其病理類型為：4例腦轉移癌，其中1例低分化腺癌，2例肺癌，1例低分化鱗癌；2例腦膠質瘤；1例乳腺浸潤性導管癌，1例肝細胞癌。所選病例標本的病理分級均為Ⅱ～Ⅲ級。

1.2 實驗試劑

主要試劑為神經元特異性烯醇化酶(NSE)、抗鼠抗人-神經膠質纖維酸性蛋白(抗鼠抗人GFAP)、S-100蛋白、NF、兔抗人SYN、NF、MBP、FV-Ⅲ、CD34。SP試劑盒均有福建邁新生物技術公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化法 ①烤片，將石蠟切片在68 ℃的溫度下處理20 min；②脫蠟和水化，使用二甲苯溶液將石蠟切片脫蠟，梯度酒精脫水；具體步驟為：二甲苯Ⅰ20 min--二甲苯Ⅱ20 min--濃度為100%酒精溶液Ⅰ20 min--濃度為100%Ⅱ10 min--95% 5 min--80% 5 min--70% 5 min；③阻斷滅活內源性過氧化物酶：濃度為3%雙氧水在37 ℃的溫度下孵育10 min，使用PBS重復沖洗5 min，沖洗3次；④抗原修復，將切片置于10 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0)中，煮沸(15～20 min，95 ℃)，進行20 min以上的自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min，重復三次清洗；⑤在37 ℃的溫度下正常羊血清工作液封閉10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗，在4 ℃溫度下孵育，PBS反復沖洗5 min，重復沖洗3次，滴加生物素標記二抗，在37攝氏度溫度下孵育30 min，PBS反復沖洗5 min，重復沖洗3次；⑦滴加辣根過氧化物標記的鏈霉素卵白素工作液，在37 ℃孵育30 min，用PBS重復沖洗5 min，重復3次；⑧H2O2/DAB反應染色，后反復沖洗蘇木精復染，脫水封片。用PBS緩沖液代替一抗用來進行陰性對照，陽性對照使用邁新公司提供的陽性對照片。

1.3.2 制作電鏡標本 ①前固定：首先將手術切除的標本使用濃度為2%的戊二醛在4 ℃的溫度下固定2 h，然后每間隔2 h換0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液固定；②后固定：使用1%濃度的四氧化鋨在4 ℃的溫度下固定2 h，后每隔15 min使用0.1 M的二甲胂酸鈉緩沖液沖洗2次；③脫水：按照如下步驟進行逐級脫水，(10 min 4 ℃ 30%酒精溶液)-(10 min 4 ℃ 50%酒精溶液)-(10 min 4 ℃ 70%酒精溶液)-(10 min 室溫 80%酒精溶液)-(10 min 室溫 90%酒精溶液)-(15 min 2次室溫100%酒精溶液)-(15 min 2次室溫環氧丙烷滲透)-【1 h室溫 1∶1(不完全包埋液∶環氧丙烷)滲透】-【1 h 室溫2∶1(不完全包埋液∶環氧丙烷)滲透】-(室溫過夜萬全包埋液滲透)；④包埋：(6 h 35 ℃溫箱完全包埋液浸泡)-(48 h 60 ℃恒溫箱 轉移至包埋板)；修塊后做半薄切片，將切片用甲苯胺染成藍色，在光鏡下選取完整的生長細胞，制備超薄切片，保證切片片厚為50～70 nm，鈾鉛染色后用型號為JEM-100的電鏡觀察。

1.3.3 結果判定標準 使用400倍視野在光鏡下對每張切片隨機選取100個目標結構細胞，按照陽性細胞比率和染色強度統計，結果陽性細胞或無染色>10%為陽性，陽性細胞和無染色≤10%為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差來表示。組內數據用t檢驗，組間對比應用one-way anova分析，若方差不符合比較要求則用組組對比。計數資料采用χ2檢驗。P>0.05為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

2.1.1 FV-Ⅲ和CD34的表達 腦轉移癌組和腦膠質瘤組中，CD34和FV-Ⅲ均有豐富的表達，其表達相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。表明腦膠質瘤和腦轉移癌組織中均建立有新生血管。如表1。

表1 FV-Ⅲ和CD34的表達(例，%)

2.1.2 GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN的表達 在腦膠質瘤組織中，GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN均強烈表達，但是在腦轉移癌組中，幾乎不表達GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN，提示腦轉移癌中沒有膠質膜成分，即沒有形成血腦屏障的最基本的結構。幾種標志物的表達2組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。如表2。

表2 2種組織中神經組織標志物的表達情況(例，%)

2.2 電鏡掃描結果

電鏡掃描結果表明，腦膠質瘤小血管出現明顯增生，血管周隙出現明顯膠質細胞終足包繞，內皮細胞出現部分變性，肥大且出現少量膠原纖維，下基底膜樣物質顯著增多。腦轉移癌患者內皮細胞連結松緊不一，纖細疏松，部分間隙擴大，常見空泡變性，基底膜不均一且較薄，與膠質瘤相比毛細血管密度略少，毛細血管周圍無膠質細胞終足，瘤細胞之間出現淋巴細胞浸潤。

3 討論

腦轉移癌在惡性腫瘤其他器官轉移中僅次于肝轉移和肺轉移，占第3位[6-7]。研究表明，轉移的癌組織常表達大量血管內皮細胞生長因子，促進形成新生血管組織，導致血漿成分滲漏。腦轉移病情嚴重，對患者生存質量造成重大影響，患者若不積極接受治療，生存期只有4周左右。血腦屏障束縛了化療治療腦轉移癌的確立，有研究表明化療對原發病灶和腦轉移有相似的療效，提示血腦屏障在腦轉移癌組織中可能遭到部分破壞，但是未見更詳細的研究[8-10]。

研究表明，血腦屏障有以下特點：①毛細血管基膜是連續的；②毛細血管中其內衣細胞連接緊密；③毛細血管基膜外有膠質膜，膠質膜有膠質細胞終足形成。本實驗得出S-100、NF、SYN、GFAP、NSE和MBP能夠標志神經膠質細胞的微絲結構或終絲結構的標志物，其中GFAP可維持和形成星形膠質細胞突起，此類成分決定著血腦屏障中是否存在膠質膜成分[11-12]。本研究表明，FV-Ⅲ和CD34在腦膠質瘤和腦轉移癌組織中均有豐富表達，表明腦膠質瘤和腦轉移癌組織中都具有供血血管。基本上S-100、NF、SYN、GFAP、和MBP在腦轉移癌組織中無表達，但是在腦膠質瘤中表達強烈，表明膠質膜成分在腦轉移癌組織中不存在，即腦轉移癌間質中，星形膠質細胞終足包繞的膠質膜在其血管壁周圍無表達；NSE的部分表達與血腦屏障沒有關系，只與原發病小細胞癌基本一致[13-16]。電鏡觀察表明，毛細血管內皮細胞在腦轉移癌中連接不均一，還會出現炎性改變或空泡變性，不存在膠質細胞終足，基底膜在血管周圍很薄。微小血管在肝轉移病例中表達為竇樣結構，表明其原發病灶與轉移瘤血管特點相同，具有中樞神經的特點。上述結論表明，腦轉移癌沒有在其演變成轉移灶的過程中形成完整的血腦屏障。

綜上所述，在腦轉移癌組織中，構成血腦屏障的基本物質神經膠質膜缺乏，血管內皮連接不緊密，即其組織中無完整的血腦屏障。