1株殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種對甲酸乙酯的降解研究

張珊珊 姚小龍 王珂 尤雅

（北京工商大學，北京 100048）

甲酸乙酯是一種常用的化工原料，常用作溶解醋酸或硝酸纖維的溶劑、香料添加劑、以及殺菌劑和殺幼蟲劑［1-3］。甲酸乙酯廣泛存在化工行業的廢水中，直接排放含有甲酸乙酯的廢水會對生物和環境造成很大的危害。當甲酸乙酯的濃度高于1 000 mg/m3時，會略微刺激人體的眼睛、鼻子和肺部。在急性吸入研究中，Opdyke等［4］發現當甲酸乙酯濃度為24 000 mg/m3時，會對6只大鼠中的5只引起致死。毒性跡象包括對中樞神經系統的抑制以及對呼吸循環的影響［5-6］。荷蘭衛生委員會關于甲酸乙酯的職業接觸限值和每日允許食品和化妝品毒理學設定的甲酸乙酯攝入限值，建議人類每天不應暴露于1 000 mg/m3以上的甲酸乙酯環境中［7］。另一方面，排入環境的甲酸乙酯揮發進入大氣后，在一定環境條件下能夠發生光化學反應，形成光化學煙霧［8-10］。因此，治理廢水中的甲酸乙酯對人類健康和環境保護都具有重要的意義。

常用的甲酸乙酯凈化方法包括吸附法［11］、Fenton氧化法等［12］，而利用生物法對甲酸乙酯的降解性能研究較少。由于生物法具備凈化效率高、成本低、對環境無二次污染等優點［13］。利用生物法處理廢水中的甲酸乙酯，對于認識甲酸乙酯在微生物中的降解機理，開發具備低成本、高降解性能的甲酸乙酯降解技術具有重要意義。

本研究中，使用甲酸乙酯為唯一碳源，通過篩選和馴化，從活性污泥中分離出一株能高效降解高濃度甲酸乙酯的細菌。研究了pH和溫度對菌株生長的影響，并研究了降解菌的生長動力學，以及不同濃度的甲酸乙酯對細菌生長及降解的影響。通過代謝產物的分析，探討細菌對甲酸乙酯的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品（活性污泥）來源 本實驗活性污泥來源于北京某污水處理廠二沉池。活性污泥樣品取樣后，置于-20℃冰箱中待后續實驗使用。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑為ZnSO4·7H2O，FeSO4·7 H2O，MnSO4·7 H2O，Co（NO3）2·6 H2O，CuSO4·5 H2O，KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4·7 H2O，NaCl，LB肉湯，蛋白胨，甲酸乙酯（北京頤豐天成科技有限公司）。主要儀器為分析天平（北京賽多利科學儀器有限公司）、生化培養箱（上海申賢恒溫設備廠）、氣相色譜質譜聯用儀（7890B Agilent）、可見光分光光度計（UNICO 2000）、高壓蒸汽滅菌器（Panasonic公司）、超凈操作臺（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）、低溫冷凍離心機（Sigma公司）、PCR 儀（TECHNE 公司）、智能冰箱（SAMSUNG公司）。

1.1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基（LB 培養基）：牛肉膏10.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調整pH值至7.0±0.2，于120℃ 滅菌15 min。

基礎培養基：蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.45 g/L，Na2HPO40.47 g/L，痕量金屬溶液 1 mL/L，pH 7.00±0.2，121℃高壓滅菌 40 min。其中，痕量金屬溶液有FeSO4·7 H2O 0.55 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.23 g/L，MnSO4·7 H2O 0.34 g/L，Co（NO3）2·6 H2O 0.075 g/L，CuSO4·5 H2O 0.047 g/L，（NH4）6MO7O24·4H2O 0.025 g/L［14］。

篩選培養基：在滅過菌的基本培養基中加入甲酸乙酯。

1.2 方法

1.2.1 甲酸乙酯降解菌的分離與純化 將活性污泥用高純水稀釋10倍，并過篩形成細菌懸浮液作為接種物。取5 mL稀釋并過篩后的活性污泥接種到45mL已滅菌的基礎培養基中，加入500 mg/L的甲酸乙酯。置于170 r/min，30℃的搖床中培養48 h。之后，將5 mL的混合物接種到新的45 mL基礎培養基中培養，并加入800 mg/L的甲酸乙酯，放于170 r/min，30℃的搖床中培養48 h。再取5 mL的混合物放入新的基礎培養基中，加入1 000 mg/L的甲酸乙酯，放于170 r/min、30℃的搖床中培養48 h。富集結束后，使用稀釋涂布法和平板劃線法篩選出能以甲酸乙酯為碳源的單菌落，并分離純化。

1.2.2 復篩降解菌株 為了選擇具有最高甲酸乙酯降解效率的菌株，進一步篩選獲得的菌株。將1.2.1節中分離出的純菌落與含有1 000 mg/L的甲酸乙酯和20 000 mg/L瓊脂的混合基礎培養基于30℃的恒溫培養箱中培養24 h。然后將純化好的菌株與5 mL無菌水混合并形成細菌懸浮液。取樣1 mL細菌懸浮液并以10 000 r/min的速度離心5 min。收集離心后的沉淀并用蒸餾水洗滌2次后并重新接種到5 mL富集培養基中，其中加入1%的甲酸乙酯。于30℃，170 r/min的搖床里培養24 h。取樣1 mL細菌懸浮液并以14 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的濾膜過濾液體。之后通過氣相色譜儀（7890B Agilent）測量甲酸乙酯的降解率。氣相色譜儀的測試方法為：色譜柱為DB-624毛細血管柱，進樣口溫度為220℃，氫火焰離子化檢測器（Flame ionization detector，FID）溫度為250℃，空氣流量為400 mL/min，尾吹氣流量為25 mL/min。柱溫：恒溫70℃，保持8 min［15］。選擇最佳降解率的菌株用于進一步研究。

1.2.3 菌株的生理生化測定 生理生化實驗：根據《常見細菌系統鑒定手冊》［16］進行革蘭氏染色試驗、吲哚試驗、葡萄糖氧化發酵試驗、V-P試驗、MR試驗等測定。

1.2.4 DNA提取和PCR擴增 鑒定菌株在30℃LB培養基中生長至對數期，1.5 mL菌液在轉速為12 000 r/min下離心收集菌體，并對該菌株16S rDNA基因序列分析。利用DNA提取試劑盒提取總DNA作為PCR模板，選用16S 菌保守序列進行PCR 擴增。16S rDNA擴增的引物為 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和 1 492R GGTTACCTTGTTACGACTT［17］。PCR 所 用 酶 為ExTaq，PCR程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環35次；72℃延伸10 min，12℃保存。得到750 bp的片段，測序得到菌株ETH-3的16S rDNA全序列，并將序列上傳到NCBI基因庫中。利用BLAST將測序結果與GenBank中的基因序列進行同源性比對。最后在MEGA 6.0軟件中繪制發育樹。

1.2.5 菌株生長曲線及其動力學的研究 取22支盛有5 mL LB肉湯的試管，滅菌后備用。其中11支接種0.25 mL已培養12 h的甲酸乙酯降解菌過夜培養液（使初始OD600達到0.01）。另11支作為對照。將22支試管置于恒溫搖床中振蕩培養，溫度設置為30℃，轉速170 r/min。每隔2 h取樣檢測其在600nm處的吸光度值。檢測篩選出的微生物生長曲線。

根據菌株在不同時間的生長數據，選擇修正Gompertz模型［18］擬合降解菌的生長曲線。通過修正Gompertz模型［公式（1）］擬合得到的模型參數，計算出最大比生長速率U［公式（2）］和微生物生長的延滯期LPD［公式（3）］。最終采用R2對建立模型進行評價。

由此可以得到U和LPD的計算公式：

式中，t為時間，Nt和N0分別表示在時間t時和初始時間時的微生物數量；a為最大菌數Nmax與初始菌數N0的差值；tc為達到最大生長速率的時間，K為在時間點tc的最大生長速率［19］。

1.2.6 菌株的最佳生長環境條件（溫度和pH） 選取不同培養溫度20、25、30、35和40℃，此時培養基的初始pH為6.60。將6份滅過菌并冷卻的LB肉湯培養基，接種已培養至對數期的菌液，使初始OD600達到0.01。分別放入20、25、30、35和40℃的恒溫搖床里，每隔4 h取樣，共取6次，每組做4個平行樣，并且用沒有接種菌的無機鹽培養基做對照。通過可見光分光光度計（UNICO 2000）測量微生物的吸光度。

選取5個pH梯度，通過1 mol/L的HCl和20%的NaCO3將初始pH分別調為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，測對菌株生長的影響。在已滅菌冷卻的LB肉湯培養基中加入培養至對數期的菌液（使加入菌液后的無機鹽培養基初始OD600為0.01），以不加菌液的體系作空白對照，置30℃、170 r/min的搖床中培養。每隔4 h取樣，每組做4個平行樣。通過可見光分光光度計（UNICO 2000）測量微生物的吸光度，用OD600作為細菌密度的指標。

1.2.7 菌株對不同濃度的甲酸乙酯降解研究 研究菌株在6個不同甲酸乙酯濃度下的降解，6個甲酸乙酯濃度梯度分別是4 000 mg/L、7 500 mg/L、10 500 mg/L、15 500 mg/L、20 500 mg/L和 60 000 mg/L。每個濃度梯度做4個平行樣。以不接菌的無機鹽培養基作為對照。對照組培養基跟實驗組的培養基在基本培養基的基礎上加入相同的培養6 h的微生物量，但是對照組中不添加甲酸乙酯。培養基中加入的微生物量為1%（體積分數）。對照組培養基和不同濃度甲酸乙酯的培養基同時置于30℃，170 r/min的搖床中培養。24 h前每隔4 h取樣，36 h時再取一次樣。檢測微生物的生長情況、pH變化及降解率的變化。所有取樣在無菌操作臺里操作。

底物中甲酸乙酯的測定方法同1.2.2節測定的方法。

1.2.8 中間代謝產物分析 選用降解后的樣品，14 000 r/min離心5 min。用0.22 μm的濾膜過濾液體。取上清液置于60℃的水浴鍋中，采用SPE（Solid phase extraction）固相微萃取技術結合GC-MS分析代謝產物成分［20］。GC-MS的分析條件為：采用程序升溫40℃（維持10 min），再以50℃·min-1的速率升到180℃（維持5 min）；進樣口溫度150℃；載氣為高純氮氣；分流比為5∶1。進樣量為1 μL。

2 結果

2.1 菌種的鑒定

2.1.1 菌株的形態特征觀察 初步篩選分離后，從活性污泥中獲得3株降解菌。進一步研究3株菌株對甲酸乙酯的降解率以篩選出具有最高降解效率的最佳菌株。在初始有機物濃度為8 000 mg/L時，36h內，在30℃下，發現ETH-3菌株對甲酸乙酯的去除率最高，高達100%。因此，選擇ETH-3進行進一步研究。菌株ETH-3肉眼可以看到清晰的單菌落，菌落較小且扁平，呈現不規則圓形，直徑0.5-3 mm左右，濕潤。其在平板上的形態如圖1所示。

圖1 菌株在平板上的形態

2.1.2 菌株的生理生化結果及分子生物學鑒定 菌株ETH-3的5個生理生化試驗結果（表1）顯示，為革蘭氏陰性菌，吲哚試驗陰性，葡萄糖氧化發酵試驗陽性，且產酸也產氣，V-P試驗陰性，MR試驗陽性。對菌株的DNA進行PCR擴增及16S rDNA基因鑒定后，根據BLAST結果，表明該菌株與Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida親源關系最近，同源性達99%以上。在NCBI上下載與菌株ETH-3所測序列較高相似性的序列，在MEGA 6.0軟件中繪制系統發育樹圖（圖3）。結合菌株的形態觀察結果及生理生化試驗結果，確定該菌株鑒定為殺蛙氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。

表1 菌株ETH-3的生理生化特性

圖2 菌株的系統發育樹圖

圖3 菌株ETH-3的生長曲線

2.1.3 菌株的生長曲線及其生長動力學研究 菌株ETH-3的生長曲線如圖3所示。運用Origin軟件，選用SGompertz模型擬合菌株遲緩期、對數期及穩定期的生長曲線，如圖4所示。得到該模型的擬合參數并計算出最大比生長速率U和微生物的延滯期LPD（表2）。模型的R2為0.999，說明SGompertz模型可以很好地描述菌株的生長。由表2可知，菌株在第5.9 h達到最大生長率速度，菌株的OD600值最高達1.723±0.015，每小時OD600值增長0.69，菌株的最大比增長速率約為0.4，延遲期大約有4.497 h。

圖4 SGompertz模型擬合菌株的生長期

表2 SGompertz模型得到的ETH-3的生長參數

2.2 初始pH和溫度對菌株ETH-3生長的影響

初始pH對菌株ETH-3生長的影響如圖5所示。如圖所示，盡管菌株在pH為5-9時都可以生長，但是當初始pH為5和9時，生長明顯受到抑制。當pH等于8左右時，最有利于菌株的生長。

圖5 初始pH對菌株ETH-3生長的影響

初始溫度對菌株ETH-3生長的影響如圖6所示。如圖所示，在22 h前，微生物的量都會隨著時間的變化而逐漸增多，當達到22 h后，開始出現衰亡期。由圖可知，雖然溫度為20-40℃時，菌株都能生長，但當溫度為25-30℃時，對菌株ETH-3生長最有利。

圖6 溫度對菌株ETH-3生長的影響

2.3 菌株ETH-3對不同濃度的甲酸乙酯的降解

菌株ETH-3對不同濃度的甲酸乙酯降解率如圖7所示，菌株對濃度為4 000、7 500和10 000 mg/L的甲酸乙酯，在24 h內的降解率已經能達到100%。當甲酸乙酯的濃度高于10 000 mg/L時，降解率隨著甲酸乙酯濃度的升高開始逐漸下降，菌株對15 500 mg/L的甲酸乙酯，36 h內最高降解率達到67%。而對20 500 mg/L濃度的甲酸乙酯，36 h內降解率最高只有53%。直至甲酸乙酯濃度為60 000 mg/L時，此時微生物對甲酸乙酯已沒有降解率。

圖7 菌株對不同濃度甲酸乙酯的降解率

圖8為微生物在不同濃度甲酸乙酯中的生長情況。由圖8可以看出，當甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L時，微生物在12 h時開始衰亡，24 h時達到穩定。當甲酸乙酯濃度為7 500 mg/L、10 000 mg/L、15 500 mg/L、20 500 mg/L時，微生物在24 h時達到微生物量的最大值，隨后緩慢減少或不變。隨著甲酸乙酯濃度的增大，微生物生長量開始減小，當甲酸乙酯濃度大于達到10 500 mg/L時，微生物的活性受到抑制。當濃度達到60 000 mg/L時，微生物徹底不再生長。

圖8 菌株ETH-3在不同濃度甲酸乙酯中的生長情況

圖9為pH隨著時間的變化曲線。從圖可知，當甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L、7 500 mg/L、10 500 mg/L、15 500 mg/L，20 500 mg/L時，即微生物能夠降解甲酸乙酯的幾組濃度實驗中，pH隨著時間先降低再升高。16 h之前，pH隨時間降低，都是從7降低至6左右。16 h后，pH隨時間升高，最高升高至8。而微生物活性受到徹底抑制的一組濃度實驗，即當甲酸乙酯濃度為60 000 mg/L時，pH隨著時間是呈現一直降低的趨勢。從整個圖來看，培養基中甲酸乙酯濃度越大，pH越低。

表3為6組不同濃度的甲酸乙酯在不同時間的降解速率。通過表3可知，微生物對6種濃度的甲酸乙酯降解最快的區間都為4 h-8 h。與圖8菌株在4 h-8 h達到最大生長率速度的結果相呼應。

2.4 中間代謝產物分析

通過GC-MS對甲酸乙酯降解中間產物的分析，得到甲酸乙酯被微生物降解的主要產物為乙醇。以10 500 mg/L甲酸乙酯在4 h時代謝產物的分析圖為例（圖10）。圖11為甲酸乙酯在4 h時降解的質譜圖。

圖9 菌株ETH-3降解不同濃度甲酸乙酯時pH隨時間的變化

表3 六組不同濃度的甲酸乙酯在不同時間的降解速率

3 討論

生物法處理有機物目前仍有很多方面等待解決，如微生物的馴化及高效降解菌的培養、工藝過程的完善、微生物降解機理的研究、占地面積較大等［21］。微生物的馴化及高效降解菌的培養是解決占地面積較大、縮短反應器啟動時間、提高降解效率的關鍵因素。本研究從活性污泥中篩選得到一株高效降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。經形態觀察、生理生化和16S rDNA鑒定，確定篩選出的菌株ETH-3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。36 h內該菌株對初始濃度0-10 000 mg/L的甲酸乙酯能實現完全降解。

微生物的生長曲線在廢水治理中具有很重要的實踐指導意義。通過對微生物生長曲線的形態分析，可以為實際處理工藝的改進提供參考［22］。本研究通過對篩選出的菌株進行生長曲線及生長動力學研究，確定菌株的最佳活性時期為5.9 h，這為實際應用中生物塔接種的菌液培養時間提供了理論依據。

圖10 10 500 mg/L甲酸乙酯在4 h時的代謝產物分析

圖11 甲酸乙酯降解4 h時的質譜圖

微生物的活性是決定有機物處理效率的關鍵因素。影響微生物活性的因素很多，主要有有機物底物濃度、溫度、pH值和溶解氧等。營養物質主要包括微生物生長所需要的能量、碳源、氮源、無機鹽成分等［23］。其中溫度和pH是影響菌株生長的最主要因素。pH在細菌代謝中起重要作用。pH值的增加可以改變生物大分子的電荷，如蛋白質和核酸，從而影響它們的生物活性。此外，它還能改變細胞膜的電荷，從而阻礙細胞膜對營養物質的吸收［24-26］。本研究中，菌株ETH-3生長的最佳pH為8。溫度可以通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構和功能以及細胞結構（如細胞膜的流動性及完整性）來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的環境溫度會導致蛋白質或核酸的變性失活，而過低的溫度會使酶活力受到抑制，細胞的新陳代謝活動減弱［27-28］。本研究中ETH-3生長的最佳溫度為25℃。這與田會芹等［29］發現對于殺鮭氣單胞菌的生長最佳pH為7.5，最佳生長溫度為28℃結果相符合。

目前尚無殺鮭氣單胞菌對廢水中甲酸乙酯的降解研究，已有的殺鮭氣單胞菌運用到污水治理的為利用殺鮭氣單胞菌治理藍藻分泌的微囊藻毒素［30］。研究甲酸乙酯的濃度對微生物降解有機物及其自身生長的影響，有利于為后續菌株的實際應用提供理論依據。當甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L時，微生物在12 h時就開始衰亡，24 h時達到穩定。可能是因為此時微生物的死亡速率大于微生物的生長速率，培養基中的微生物繼續對剩余的甲酸乙酯進行降解，直至甲酸乙酯24 h時降解完全，此時培養基中的微生物數量不再有明顯的變化。當甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L、7 500 mg/L和10 000 mg/L時，微生物在24 h時停止生長，因為此時培養基中的甲酸乙酯被完全降解，碳源被完全消耗。培養基中已無法提供足夠的營養給菌株生長。當甲酸乙酯濃度高達20 500 mg/L時，此時有機物的濃度已經會對微生物的生長受到抑制，當濃度達到60 000 mg/L時，微生物的活性被徹底抑制，是因為此時高濃度的甲酸乙酯對微生物產生了毒性抑制作用［31］。甲酸乙酯在4-8 h降解速率最快的主要原因是此時微生物處于對數期，菌株在4-8 h的生理活性最高，細胞分裂繁殖最為旺盛［32］。隨著菌株慢慢達到穩定期和衰亡期，菌株對甲酸乙酯的降解速率也隨著減慢。

本研究發現在對每組不同濃度的降解實驗檢測pH時，不加菌的對照組和微生物活性受到抑制的濃度實驗，pH是隨著時間一直降低的，主要是因為甲酸乙酯會水解成甲酸等酸溶液，造成pH的降低［33］。甲酸乙酯濃度越高，其自身水解和被微生物降解的甲酸量越多，從而解釋了甲酸乙酯濃度越大，pH越低。而加了菌的，且甲酸乙酯濃度未達到抑制微生物生長的幾個濃度實驗中，推測有堿性產物的產生，才導致pH升高。并且菌株ETH-3在pH為8時，生長的最好。堿性產物的產生，且此時pH未超過8，能促進微生物的生長。

由甲酸乙酯代謝產物的分析，結合甲酸乙酯降解過程中pH的變化圖，推測甲酸乙酯先被微生物降解為甲酸和乙醇，在12 h時，甲酸被微生物進一步降解為CO2和H2O，導致酸性下降，pH上升。乙醇被微生物降解的主要途徑是由乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）和CYP2E1水解成乙醛和甲酮，乙醛繼而由乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）水解成乙酸，乙酸再變為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環，最終代謝為CO2和H2O［34-36］。

4 結論

本研究從活性污泥中篩選得到一株高效降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。經形態觀察和16S rDNA鑒定，確定篩選出的菌株ETH-3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。選出的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）的最佳生長溫度為25℃，最佳生長pH為8。通過對6個不同濃度的甲酸乙酯的降解實驗發現，在30℃下，轉速為170 r/min時，36 h內菌株對初始濃度0-10 000 mg/L的甲酸乙酯能完全降解。通過對甲酸乙酯代謝產物的分析，及菌株代謝甲酸乙酯過程中pH的變化推測菌株代謝甲酸乙酯的途徑為：甲酸乙酯先被微生物降解成甲酸和乙醇，甲酸被微生物進一步降解為CO2和水。該菌株具有較好的溫度適應性以及對甲酸乙酯的高效降解性，具有一定的商業應用價值。