解淀粉芽孢桿菌M1搖瓶發酵條件優化及脫氮性能評價

李麗 嚴月根 吳華明

（博瑞德環境集團股份有限公司，南京 210048）

水體氮元素污染本質上是水體中含氮量超過環境承受的限值而造成的一系列現象和結果。未處理的廢水中，氮元素主要存在形式為有機氮和氨氮，二級生化處理后，氮元素的主要存在形式是氨氮和硝態氮。水體中氮元素污染的主要危害有：引發水體黑臭［1-3］；引起水體富營養化［4-6］以及對水生生物造成傷害［7］。

水體脫氮常見的方法有物理法、化學法、生物法［8］。物理法有氨的空氣吹脫法、電滲析法、反滲透法等，化學法有折點加氯法、選擇性離子交換法、磷酸銨鎂沉淀法等，生物脫氮法有傳統硝化-反硝化、短程硝化反硝化、厭氧氨氧化等。物理化學脫氮方法成本高、易產生二次方法，生物法投資運行費用低、環境友好，是理想的脫氮方式。

本實驗室從活性污泥中分離出一株具有良好反硝化脫氮活性的菌株M1，經16S rDNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌產生的芽孢具有極強的抗逆性，可耐高溫、輻射等惡劣條件，提高解淀粉芽孢桿菌的芽孢產量，有利于提升微生物菌劑的穩定性和壽命。為了進一步提高M1菌株液體發酵產芽孢量的水平，本研究運用單因子實驗和正交試驗，優化芽孢桿菌M1的培養基成分和培養條件，并考察了該菌株對實際廢水的生物脫氮效果，為該菌株的產業化應用提供基礎技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本實驗室從活性污泥中分離并保存的解淀粉芽孢桿菌M1，其具有良好的反硝化脫氮活性。

1.1.2 主要儀器和試劑 蔗糖、硫酸銨、尿素、丁二酸鈉、氯化鈉等，分析純AR，國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、瓊脂粉等，生化試劑BR，國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉等，生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司。

ZQZY-AF8組合式全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；HQ40d pH計，瑞士梅特勒公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；KH-300DE型數控超聲清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SWCJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司；WGLL-230BE電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.1.3 培養基 M1菌株斜面培養基、種子培養基和基礎發酵培養基均為LB培養基。

LB培養基組成為：10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl，調節pH為7.2，120℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體LB培養基，瓊脂含量為20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株M1培養方法 菌種活化方法：將保存的菌種轉接至斜面培養基，30℃活化24 h。

種子液培養方法：用接種環挑取1環菌泥，接入裝有10 mL LB培養基的50 mL搖瓶中，30℃活化22 h。

菌株培養方法：采用裝有100 mL LB培養液的250 mL搖瓶培養，接種量1%，于30℃、200 r/min培養48 h，取樣測定活菌數和芽孢數。

1.2.2 芽孢計數法 采用平板計數法［9］，計數前將菌液在80水浴中熱處理15 min。

1.2.3 發酵培養基成分的單因子篩選 在LB培養基和30℃、200 r/min培養條件下，考察不同營養成分及濃度對M1液體發酵產芽孢量的影響。每個處理重復3次。

1.2.3.1 碳源種類 在基礎培養基中原有成分不變的前提下，分別添加10 g/L甘露醇、蔗糖、麥芽糊精、海藻糖、乙酸鈉、木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖、丁二酸鈉，選擇最優碳源。

1.2.3.2 碳源濃度的選擇 上述篩選得到的最佳碳源，考察其濃度（5、10、15、20、25和30 g/L）對菌株M1液體發酵產芽孢量的影響。

1.2.3.3 氮源種類 以可溶性淀粉為碳源，分別添加10 g/L的硝酸鉀、硫酸銨、尿素作為單一氮源及1∶1、1∶2、1∶3的胰蛋白胨和酵母粉作為混合氮源加到基礎培養基中，篩選最優氮源。

1.2.3.4 氮源濃度的選擇 上述篩選得到的最佳氮源，考察其濃度（5、10、15、20、25和30 g/L）對菌株M1液體發酵產芽孢量的影響。

1.2.3.5 NaCl濃度的選擇 改變基礎培養基篩選中的 NaCl濃度（1、3、5、7、10、15和 20），篩選出最優的NaCl濃度。

1.2.4 最佳培養條件的篩選 在LB基礎培養基、培養時間為48 h的條件下，研究接種量（0.5%、0.75%、1%、2%、5%、7%和10%）、裝液量（25、50、75、100 和 125 mL）、pH（6.5、7、7.5、8、8.5 和 9）、培養溫度（24、28、32、36和40℃）和轉速（120、140、160、180和200 r/min）對菌株M1液體發酵的影響。每個處理重復3次。

1.2.5 正交試驗 根據單因子試驗結果，選擇對菌株M1產芽孢量影響顯著的溫度、裝液量、接種量、氮源濃度為考察因素，按正交試驗表L9（34）設計4因素、3水平的正交試驗（表1），比較各種發酵條件組合對菌株M1產芽孢量的影響。其他試驗條件：可溶性淀粉 5 g/L，NaCl 1 g/L，初始pH值6.5，搖床轉速180 r/min，酵母粉：胰蛋白胨=2∶1。

1.2.6 反硝化脫氮實驗裝置 實驗采用自制SBR反應器，反應器有效容積為2 L，高200 mm，內徑140 mm。反應裝置在30℃恒溫水浴下運行，攪拌方式為磁力攪拌。

1.2.7 污泥特性及污水水質 實驗接種污泥取自南京市某污水處理廠缺氧池，該污泥的MLSS濃度為7 800 mg/L，MLVSS/MLSS為0.90，呈紅褐色。將此活性污泥用紗布過濾除去塑料袋、石子等雜物，用蒸餾水清洗3次，按接種濃度3000-4000 mg/L接種。

實驗廢水取自同一污水處理廠勻質池出水，水質 特 征 為 pH=7.45，COD=11000 mg/L，TOC=2634mg/L，TN=1284 mg/L，NO3--N=1281 mg/L，TP=1.0 mg/L。將此污水稀釋10倍，作為實驗用水。

活性污泥經20 d馴化，運行穩定后，開始反硝化脫氮評價實驗。

1.2.8 評價方法 采用前述優化工藝，搖瓶發酵制備M1菌液，在3 000 r/min條件下離心10 min，收集菌泥，生理鹽水洗滌2次。分別考察不同的投加量（0.5%、0.7%、1%、3%和5%）及不同的HRT（2、4、6、8和10 h）對反硝化脫氮效果的影響。

1.2.9 分析方法 NO3--N、MLSS、MLVSS等按標準方法［10］測定。

1.2.10 數據處理 利用Excel 2007繪圖，用SPSS22分析軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 發酵時間的確定

發酵時間分別為24、36、48、60和72 h時，對應的活菌數分別為：8.3×107、2.58×108、3.2×108、3.3×108和2.88×108CFU/mL，對應的芽孢數分別為：7.8×107、1.58×108、2.08×108、1.72×108和 1.55×108CFU/mL，芽孢數在48 h時達到最大值，故選擇48 h作為發酵時間。

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源種類的篩選 由圖1可知，不同種類的碳源對芽孢桿菌M1活菌數及產芽孢量的影響很大（P＜0.05），其中可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糊精能明顯促進菌株M1生長，木薯淀粉、丁二酸鈉、海藻糖對菌株M1生長影響不明顯（P＞0.05），甘露醇、蔗糖、葡萄糖不利于菌株M1生長（P＜0.05）。木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉利于芽孢形成，馬鈴薯淀粉、丁二酸鈉對芽孢的形成無明顯影響，麥芽糊精對芽孢的形成有輕微的抑制作用（P＞0.05），葡萄糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖不利于芽孢的產生（P＜0.05）。

綜合考慮M1菌株活菌數及芽孢數，可以確定可溶性淀粉為菌株M1最佳碳源。

圖1 不同碳源對M1菌株發酵的影響

2.2.2 可溶性淀粉濃度的優化 可溶性淀粉濃度分別為5、10、15、20、25及30 g/L時，菌株M1活菌數從 3.2×108CFU/mL、依次降至 2.4×108、2.2×108、2.5×108、2.2×108和 2.1×108CFU/mL，芽孢數從2.2×108CFU/mL、 依 次 降 至 1.4×108、1.3×108、1.2×108、1.2×108和 1.1×108CFU/mL。5 g/L 為 可溶性淀粉最優添加濃度，此時活菌數和芽孢數達到最大值。

2.2.3 氮源的篩選 由圖2可知，不同氮源對M1菌株活菌數及產芽孢數具有顯著的影響（P＜0.05）。當酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1時，M1菌株活菌數和芽孢數均達到最大值，其次是酵母粉：胰蛋白胨=1∶1，當酵母粉：胰蛋白胨=3∶1時，與空白對照相比，活菌數略微降低，芽孢數升高（P＞0.05），硝酸鉀、硫酸銨、尿素不利于M1菌株生長和芽孢產生（P＜0.05）。綜合考慮M1菌株活菌數和芽孢產量，以酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1作為優選氮源。

圖2 不同氮源對M1菌株發酵的影響

2.2.4 優選氮源濃度的優化 按照2.2.3中研究結果，以酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1作為氮源，考察不同的氮源濃度對菌株M1發酵培養的影響（圖3）。隨著氮源濃度的增加，菌株M1的活菌數和芽孢數呈現先增大后減少的趨勢，在氮源濃度為10 g/L時，活菌數和芽孢數達到最大值。當氮源濃度≥15 g/L時，活菌數和芽孢數迅速下降。以芽孢數為參考指標，優選的氮源濃度為 10 g/L。

2.2.5 NaCl濃度的優化 NaCl濃度對M1菌株活菌數和芽孢數都有顯著影響。當NaCl濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%、15%和20%時，M1菌株的活菌數分別為：4.8×108、6.8×108、4.8×108、4.4×108、4.0×108、5.9×108和 6.2×108CFU/mL，芽孢數分別為：2.6×108、2.5×108、2.1×108、1.8×108、1.7×108、1.7×108和1.7×108CFU/mL。M1菌株的芽孢數隨著NaCl濃度的增加，逐漸減少。以芽孢產量為標準，最優的NaCl濃度為1 g/L。

2.2.6 初始pH的篩選 當初始pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9時，菌株的活菌數分別為：5.6×108、7.1×108、6.4×108、7.2×108、5.2×108和 6.4×108CFU/mL，芽孢數分別為：2.3×108、1.8×108、1.7×108、1.6×108、1.6×108、1.5×108CFU/mL。以芽孢產量為標準，最佳的初始pH值為6.5。

圖3 氮源濃度對M1菌株發酵的影響

2.2.7 最佳裝液量的篩選 裝液量對M1菌株活菌數和芽孢量的影響見圖4。M1菌株活菌數隨著裝液量的增加呈現先減少后增大的趨勢，在裝液量為50 mL時達到最大值。M1菌株的芽孢量隨著裝液量的增加呈現先增大后減少的趨勢，在裝液量為50 mL時，芽孢數和芽孢產率最高，分別為3.1×108CFU/mL和62%，在250 mL三角瓶中，最佳裝液量為50 mL。

圖4 裝液量對M1菌株發酵的影響

2.2.8 培養溫度的篩選 溫度對菌株M1活菌數和芽孢數具有顯著的影響（圖5）。隨著溫度的升高，菌株M1的活菌數和芽孢數呈現先增大后減少的趨勢，在溫度為32℃時，活菌數和芽孢數最大，因此，優選的培養溫度為32℃。

2.2.9 搖床轉速的篩選 搖床轉速分別為120、140、160、180和200 r/min時，菌株M1活菌數分別為2.07×108、2.1×108、2.38×108、3.08×108和 2.17×108CFU/mL， 芽 孢 數 分 別 為 1.05×108、1.17×108、1.43×108、2.40×108和 1.95×108CFU/mL。優選的轉速為180 r/min，此時活菌數和芽孢數達到最大。

圖5 溫度對M1菌株發酵的影響

2.2.10 接種量的篩選 不同接種量對M1菌株發酵影響見圖6。在接種量為7%時，活菌數及芽孢數達到最大，為2.53×108CFU/mL，高于或低于接種量7%，均不利于芽孢的產生。故選擇7%為最優接種量。

圖6 接種量對M1菌株發酵的影響

2.3 正交試驗設計及結果

上述2.2中考慮了各因素對M1菌種發酵水平的影響，挑選其中對產芽孢量影響較為顯著的影響因子初始溫度（A）、裝液量（B）、接種量（C）和氮源濃度（D），按正交試驗表L9（34）設計4因素、3水平的正交試驗，進一步確定影響M1菌株發酵產芽孢的實驗條件。正交試驗影響因素水平見表1，實驗結果見表2。

表1 L9（34）正交試驗影響因素水平表

表2 正交試驗結果表

從表2中的實驗結果可知，各因素對M1菌株發酵產芽孢數的影響次序為：C＞B＞A＞D，最優方案為A3B3C2D1，即發酵溫度34℃，裝液量75 mL，接種量7%，氮源濃度10%，此時菌粉芽孢數為6.8×108CFU/mL。采用優化后的工藝參數，發酵制備芽孢桿菌M1，芽孢數量高于優化前的2.08×108CFU/mL。

2.4 反硝化脫氮評價實驗結果

不同投加量對反硝化脫氮影響較大，隨著投加濃度的增加，反硝化脫氮效果不斷提升。當投加量超過1%時，反硝化脫氮效果提升幅度不明顯（圖7）。當HRT≥10 h，所有實驗組中硝態氮完全去除。當投加量為1%時，HRT分別為2 h、4 h和6 h時，與空白組相比，加入菌種M1后，系統反硝化脫氮活性分別提升15%、27%和34%。實驗說明，系統加入菌種M1后，對反硝化脫氮生物增效作用明顯，M1具備良好的工業應用前景。

圖7 投加量對反硝化脫氮效果的影響

3 討論

解淀粉芽孢桿菌可應用于環保、生物農藥、養殖和畜產品加工等領域。不同研究者對解淀粉芽孢桿菌發酵條件優化研究的結果不盡相同［11-14］，其原因可能是具體菌株不同、研究目的不同。培養基組分和操作條件對解淀粉芽孢桿菌的發酵具有重要影響，張子豪［15］等發現最佳碳源為淀粉，氮源為質量比為1∶1∶2的酵母浸出物、胰蛋白胨和尿素。汪晶晶等［16］發現優選的碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏、pH為7.0，發酵溫度28℃。李鑫等［17］發現最佳的發酵溫度為37℃、初始pH為7.0。曹雪梅等［18］發現優選的碳源為糊精、氮源為牛肉膏、溫度28℃，pH為7.0。He等［19］發現優選的pH為6.2，溫度為37℃。王卉等［20］發現發酵溫度為32℃時，活菌數最大。前述解淀粉芽孢桿菌優選的初始pH值一般在中性及偏酸性條件下，與本工作結果相同。本研究結果表明，當培養基組分為5 g/L碳源（可溶性淀粉）、10 g/L 氮源（酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1）、1 g/L NaCl，培養條件為初始pH 6.5、發酵溫度34℃、搖床轉速180 r/min、培養瓶裝液量30%、接種量7%時，M1活菌數和芽孢數較優化前分別提升了1.2、2.3倍。本工作僅對菌株M1的搖瓶發酵條件做了較為基礎的研究，后續還需要進行發酵罐小試和中試實驗，對發酵過程進行控制優化［21］，同時需要考察消泡劑、無機鹽［22］等因素對發酵的影響。

生物脫氮具有環保、經濟的特點，在治理水體富營養等領域具有較為廣泛的應用［23-26］。本工作采用優選的發酵條件，發酵制備M1菌液，離心洗滌、濃縮后，投加量為1%，HRT分別為2 h、4 h和6 h時，與空白組相比，系統反硝化脫氮活性分別提升15%、27%和34%。實驗說明反硝化脫氮菌M1具有良好的工業應用前景。后續需要做更為系統的實驗，詳細考察菌株M1的反硝化脫氮特性。