重組人SOD1/3轉基因山羊的制備及表達產物的檢測

周敏雅 陸睿 張婷 袁婷婷 盧瑤瑤 嚴坤寧 袁玉國 成勇

（1. 揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2. 揚州大學醫學院，揚州 225009）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是廣泛存在于生物界的一類金屬酶，它能清除機體內多余的活性氧。哺乳類動物和人體內僅含Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）及 EC-SOD（SOD3），其中SOD1和 SOD3 同屬于Cu/Zn-SOD，前者存在于細胞內，后者位于細胞外液中［1］。據報道［2］，在哺乳動物體內 Cu/Zn-SOD 的穩定性和含量均高于Mn-SOD，因此Cu/Zn-SOD在臨床應用上更受重視。

隨著人們對高質量生物制品的需求日益增大，通過轉基因技術制備的重組蛋白開始不斷涌現。與其他表達系統相比［3］，轉基因動物乳腺生物反應器具有高表達、高生物學活性、蛋白翻譯后可修飾及不產生內毒素等優勢，是極具發展前景的制藥新途徑之一。本實驗室在應用乳腺生物反應器表達功能性蛋白的技術已較成熟［4-5］，其中Song（宋紹征）等［6］在轉基因兔乳腺生物反應器表達重組人纖溶酶原激活劑的研究中，rhPA 濃度最高可達 630 μg/mL，表達產物比活性是現有阿替普酶的 360 倍。由此可見，乳腺生物反應器具有生物活性高、生產成本低等優點。

目前，能利用宿主生物體來表達多種異源蛋白的方法有共整合［7］和元表達載體系統［8］，前者是轉基因通過內部核糖體進入位點（Internal ribozyme entry site，IRES）連接，但不同的基因之間總是影響彼此的表達；通常是5'區相對高于3'區，而且每個基因的表達水平均會相對低于單基因整合個體。然而，在二元載體系統中，這兩個載體具有獨立的表達調節區，不存在彼此影響。因此，我們選用二元載體系統開展研究。此外，為提高轉基因效率，我們嘗試僅用一個載體含標記基因來篩選獲得雙載體共轉染的重組陽性克隆細胞株，并通過體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術生產雙轉基因克隆山羊。

在本研究中，通過酶聯免疫吸附測定（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、Western blotting和體外活性實驗等方法檢測到rhSOD1和rhSOD3能在山羊乳汁中有效表達，從而表明成功構建了攜帶山羊 β-酪蛋白/CMV 雜合啟動/增強子優化的hSOD1和hSOD3編碼序列的二元表達載體。因此，本實驗設計用乳腺生物反應器來生產rhSOD1、rhSOD3蛋白是可行的，為后續純化和大批量生產rhSOD蛋白提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺特異性表達載體 山羊乳腺特異性表達載體以山羊beta酪蛋白為表達調控序列，雞beta珠蛋白為隔離原件，CMV為增強子；hSOD1、hSOD3 cDNA為功能基因，序列來自NCBI，編號分別如下：

1.1.2 試劑 內切酶、Taq酶購自日本TaKaRa公司；T4 DNA連接酶，購自美國Promega公司；G418培養基（E859，Amresco，美國）；膠回收純化試劑盒（D2500-01，OMEGA，美國）；FSH（110044629，寧波三生藥業有限公司）；PVDF膜購自美國Pall公司；ElISA試劑盒等購自上海生工；其他試劑無特殊說明，均購自美國Sigma 公司。

1.1.3 主要實驗儀器和器械 基因擴增儀（S1000型，BIO-RAD，美國）；DNA電泳槽、電泳儀（NJ400型，南京新校園儀器）；Multiporator多功能細胞電轉染儀（Eppendorf，德國）；凝膠成像儀（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）；超凈工作臺（SJ-CJ-1BQ型，蘇州凈化儀器設備廠）；倒置顯微鏡和顯微操作儀（Leica，德國），體視顯微鏡（廈門麥克奧迪公司），CO2培養箱（No.3111，Forma Science Inc. 美國），拉針儀（PB-7 Micropipette Puller，Narisgige，日 本），DNA 擴增儀（S1000 Thermal Cycler，Bio-RAD，美國），酶標儀（RT-6000，Rayto，深圳），醫用低溫保存箱（DW-86L626，青島海爾公司）；常規手術器械等。

1.1.4 實驗動物 體成熟的山羊購自江蘇省內，飼養于揚州大學獸醫學院。

1.2 方法

1.2.1 構建載體與回收片段 合成的hSOD1、hSOD3 cDNA序列（上海生工）插入至本實驗室保存的含有上述表達調控元件的乳腺特異性表達載體pCL25的XhoI酶切位點處并在pCL25/hSOD1的NheI酶切位點處插入Neor基因，經測序及序列結果比對，篩選獲得與理論序列一致的表達載體。構建成的乳腺特異性表達載體命名為rhSOD1、rhSOD3（圖1）。rhSOD1和rhSOD3乳腺特異性表達載體分別以SalI+NotI雙酶切獲得16.8 kb和16.3 kb的真核表達基因片段［8］，經膠回收試劑盒（D2500-01，OMEGA，美國）回收片段，分別溶于滅菌雙蒸水，以供細胞轉染。

1.2.2 應用電轉染制備雙基因共整合的奶山羊胎兒成纖維細胞 從液氮灌中取出凍存的原代山羊胎兒成纖維細胞，復蘇培養至P2代，待細胞長至鋪滿板底時，用細胞消化液（0.05% 胰酶+0.04% EDTA）消化收集細胞，離心后用低滲電轉染液（Eppendorf，德國）清洗并計數［9］；用電轉液懸浮細胞至細胞密度至2×106個/mL，分別加入4 μg 的rhSOD1 和rhSOD3片段，將混合液轉移至徑寬為2 mm電轉染杯（Eppendorf，德國），在 250 V，300 μs 條件下電擊 2 次，使rhSOD1、rhSOD3共轉染山羊胎兒成纖維細胞。電轉染24 h后轉至6孔細胞培養板，用G418（800 μg/mL，Amresco，美國）的抗性培養液培養，篩選10 d，將篩選到的單克隆細胞株擴大培養，培養48 h后收集1/4的細胞用于PCR整合檢測，剩余的細胞凍存于液氮中。

圖1 乳腺特異性表達載體 rhSOD1和rhSOD3

1.2.3 胎兒成纖維細胞的轉基因檢測 用 60 μL/孔細胞裂解液（40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.9）于 45℃裂解1 h，取 5 μL 作為模板進行 PCR 反應，檢測引物為 CMV-SOD 跨接頭引物 CMV-rhSOD1-C 組 和CMV-rhSOD3-C組見表1，PCR 產物進行測序驗證。

1.2.4 制備雙基因共整合山羊 獲得的雙基因共整合的單克隆細胞株作為供核細胞，以MII期的山羊卵母細胞經去核處理后作為核受體，進行體細胞核移植，選擇狀態佳的重構胚，移植到同期發情的受體山羊輸卵管中。術后一個月，通過B超檢測受體山羊的妊娠狀況。

1.2.5 出生的克隆山羊外源基因整合檢測 剪取出生小羊的耳尖皮膚，經組織裂解液與蛋白酶K消化5 h 后，提取耳組織DNA。檢測引物為CMV-SOD 跨接頭引物 CMV-rhSOD1-G 組 和 CMV-rhSOD3-G組見表1。其中，rhSOD 1的 C組與G組的PCR 參數為：95℃ 預變性 5 min；94℃變性 1 min，60℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共 33個循環；最后 72℃延伸 10 min。

rhSOD 3的 C組與G組的PCR參數為：95℃ 預變性 5 min；94℃變性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 33個循環；最后 72℃延伸 10 min。

表1 PCR檢測所用引物

1.2.6 Western blotting檢測 采集SOD-1 與正常山羊的乳汁樣品，離心（4℃，5 000 r/min，40 min）吸取乳清，盡量避免吸取下層渾濁物。取30 μL乳清和6 μL 6×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混勻，煮沸10-15 min，冷卻后依次加入凝膠孔內，同時設置正常山羊乳清作為陰性對照，PBS作為空白對照，重組人SOD1（Thermo Fisher，美國）和重組人SOD3（CUSABIO，武漢）作為陽性對照，運行電泳使蛋白分離；再通過膜轉印將蛋白轉移至 PVDF 膜上，將PVDF膜轉置于潔凈的平皿中加入 10 mL 含5% FBS的TBST封閉液，使其充分浸沒，4℃ 過夜封閉；第2天早上取出后用TBST沖洗3次；置于15 mL 以1∶2 000 稀釋的兔抗人 SOD1 或兔抗人 SOD3 抗體，37℃搖床孵育1.5 h 后TBST沖洗3次；再將膜浸沒于以1∶1 000稀釋的羊抗兔酶標二抗IgG-HRP，37℃ 搖床孵育1.5 h后用TBST沖洗3次，通過 TCL顯色并記錄。

1.2.7 轉基因山羊乳汁中 rhSOD 的 ELISA 檢測 收集SOD-1和正常山羊第 5、10、15和20 d 的乳汁，離心（4℃，5 000 r/min，40 min）吸取乳清。通過酶聯免疫吸附法測定 rhSOD1 和 rhSOD3 的表達水平，同時將 hSOD1 或 hSOD3 標準品設為陽性對照，正常山羊乳清為陰性對照，PBS為空白對照。本實驗選用兔抗人SOD1或兔抗人SOD3 作為一抗，使用時經抗體稀釋液以1∶2 000比例稀釋，37℃孵育1 h；棄去一抗后，加入經抗體稀釋液以1∶1 000 稀釋的羊抗兔酶標二抗 IgG-HRP，37℃孵育1 h；通過TMB 顯色，應用酶標儀測定 OD450值。

1.2.8 轉基因山羊表達產物的體外活性檢測 用WST-8試劑盒測定羊奶中總的重組人SOD酶活性，實驗步驟參照說明書進行。在吸光度為450 nm 處，測OD值，并計算乳清中所含總的重組人SOD酶活性。

2 結果

2.1 獲得轉hSOD1、hSOD3基因的山羊胎兒成纖維細胞系

分別用5 μg的 rhSOD1、rhSOD3片段共轉染奶山羊胎兒成纖維細胞，通過用含G418的培養液進行篩選10 d，共獲得19株單克隆轉基因細胞，經PCR檢測后篩選出其中rhSOD1與rhSOD3雙基因整合的單克隆細胞株6株（其中rhSOD1、rhSOD3擴增產物的片段大小分別為673 bp和414 bp）見表2。PCR鑒定結果，見圖2。

表2 胎兒成纖維細胞整合數據分析

圖2 胎兒成纖維細胞細胞系rhSOD1、rhSOD3基因的PCR檢測

2.2 雙基因整合克隆山羊的出生

本實驗通過體細胞核移植技術制備轉 rhSOD1、rhSOD3 雙基因克隆羊。我們共進行了2次克隆實驗，超排6只供體山羊，獲得27枚MII期卵母細胞，得到23枚重構胚，移植2只受體山羊。在術后35 d 通過B超檢查發現一只受體山羊呈妊娠陽性，待自然分娩，產下一只雌性羔羊（圖3），記編號為SOD-1。

圖3 轉雙基因克隆山羊

2.3 克隆山羊的PCR檢測結果

提取SOD-1的基因組，通過PCR初步檢測及序列分析表明該克隆羊整合了 rhSOD1、rhSOD3 雙基因，其中rhSOD1、rhSOD3擴增產物的片段大小分別為621 bp和592 bp。PCR檢測結果如圖 4。

圖4 rhSOD1、rhSOD3雙基因共整合山羊的檢測鑒定

2.4 rhSOD在乳汁中的特異性表達

轉基因山羊SOD-1和正常山羊的乳清經 Western blotting 檢測，結果（圖5）表明，在轉基因山羊SOD-1的奶樣中檢測到rhSOD1和 rhSOD3，而在正常山羊的奶樣中，沒有檢測到相應的蛋白。rhSOD1和rhSOD3的大小分別約為16 kD 和32 kD。

2.5 轉基因山羊乳汁中rhSOD 的ELISA檢測結果

SOD-1的乳清經 ELISA 檢測，檢測到 rhSOD1和 rhSOD3， 含 量 分 別 為 88.81± 8.36 mg/L和267.82± 12.67 mg/L。圖6、圖7和表3、表4中結果均為乳清樣品經PBS稀釋10倍后實驗所得。

圖5 Western blot檢測分析轉基因山羊乳中rhSOD的表達

圖6 rhSOD1的ELISA檢測圖

圖7 rhSOD3的ELISA檢測圖

表3 檢測乳清樣品中rhSOD1的濃度

表4 檢測乳清樣品中rhSOD3的濃度

2.6 轉基因山羊乳汁中rhSOD的體外活性檢測

經WST-8試劑盒檢測，結果（表5）顯示，轉基因山羊乳清中SOD總活性的平均值為1432±157 U/mL，正常山羊乳清的SOD活性為3.4 U/mL。表明該雙轉基因克隆山羊的表達產物具有較好的生物學活性。

表5 轉基因山羊乳清中rhSOD的酶活性

3 討論

目前，國內外報道的多數 rhSODs是由大腸桿菌［10-11］、畢赤酵母［12］、釀酒酵母［13-14］、昆蟲細胞［15］、中國倉鼠卵巢細胞［16］、植物［17-18］及雞［19］等系統表達，而應用轉基因動物乳腺生物反應器同時表達rhSOD1 和 rhSOD3 尚未見報道。本實驗通過Western blot分析發現，表達的hEC-SOD分子量約為32 kD，而hEC-SOD的理論分子量為26.7 kD，從兩者的差異來看，在轉基因山羊奶中表達的 hEC-SOD蛋白為該蛋白的糖基化形式［19］。研究發現，在山羊奶中檢測到的 rhSODs 與野生型hSODs具有相似的分子量和生物學活性，表明 rhSODs在乳腺上皮細胞中能正確折疊和進行多種修飾，更接近天然結構；同時，可以避免大腸桿菌系統中可能存在內毒素污染問題的發生［12，20］。與之相比，上述原來的表達系統還存在其他缺陷，如在畢赤酵母、昆蟲細胞和CHO細胞中表達的重組蛋白，其糖基化過程不是錯誤的就是不完整的［21］。

山羊奶中某些氨基酸含量較高（特別是含硫），以及豐富的飽和短鏈脂肪酸和礦物質（主要是K、Ca、Mg、Fe 和 Cu）。因此，與牛奶相比具有更高的緩沖容量和更豐富的營養價值［22］。1998年，Gui等［23］在SODs的穩定性研究中發現，采用經典的巴氏殺菌法殺菌后仍然可以保持其生物活性，說明該轉基因羊奶可以用于生產鮮乳制品。2009年，Milesi等［24］報道口服SODs可能存在緩解疼痛的效果，尤其是在減輕壓力和緩解疲勞上。由此推出，口服含SODs的山羊奶具有極高的營養價值與有益的護理作用。

雙載體系統在多種物種間都能有效表達，如大腸桿菌、果蠅［25-26］、中國倉鼠卵巢細胞［27］和家蠶［28］等。然而，在中大型動物生物反應器上運用雙載體來表達重組蛋白是少見的。本研究構建的雙載體表達系統在山羊乳腺中能有效表達，表明這兩個載體均保持完整，且獨立表達，互不影響。這是第一個在轉基因羊奶中同時表達具有生物活性的hCuZn-SOD和hEC-SOD的研究，并且轉基因克隆山羊及其后代沒有表現出異常，說明我們的表達載體和rhSODs沒有影響山羊的正常生長發育與繁殖。

應用可選擇標記基因（Selectable marker gene，SMG）是篩選轉基因細胞系和生產轉基因山羊的關鍵步驟。目前的研究表明，僅用一種轉基因含標記基因（SMG）來篩選出具有雙基因的轉基因細胞系是可以的。這一發現可以提高轉基因效率，減少工作量。例如，在我們的研究中hSOD1用新霉素抗性基因標記，而hSOD3不采用標記基因，兩者在共轉染后會出現4種情況：（1）只轉成功hSOD1；（2）只轉成功hSOD3；（3）hSOD1和hSOD3均轉成功；（4）均未轉失敗，但是空的。其中，能存活下來的只有情況1和3，大大縮短時耗。因此，我們設計僅用一個載體含標記基因的雙載體表達系統來制備轉基因動物。在我們的研究中，rhSOD1在3'位點有一個新霉素抗性基因，而rhSOD3沒有，將雙轉基因山羊與野生型公羊交配，以期獲得rhSOD3單基因整合的山羊不帶標記基因。這將是在不需要SMG的情況下提高轉基因山羊上調基因的有效方法。

在本研究中，我們通過SCNT技術成功制備出能同時表達hSOD1和hSOD3轉基因克隆山羊。結果表明，將兩個獨立的載體共整合入供體細胞中，其轉基因細胞系具有去分化和發育的潛力。

4 結論

本研究表明，整合了hSOD1或hSOD3功能基因的兩個乳腺特異性表達載體均可在轉基因山羊奶中表達，且重組蛋白保持其生物學活性。本研究通過一個載體標記Neo基因的雙載體表達系統共轉染到山羊胎兒成纖維細胞中，獲得了雙轉基因細胞系，并應用體細胞核移植制備出雙轉基因山羊。在乳腺中表達 rhSDODs 鮮有報道，本研究為未來大規模生產rhSODs用于食品、化妝品、醫療等領域開辟了一條新路徑。