高粱A1型細胞質雄性不育系與保持系線粒體基因組分析比較

王平 叢玲 王春語 朱振興 A Ashok Kumar 張麗霞 陸曉春

（1. 遼寧省農業科學院高粱研究所，沈陽 110161；2. 國際熱帶半干旱地區作物研究所，帕坦奇魯 印度502324）

細胞質雄性不育系（Cytoplasmic male sterility，CMS）的發現和利用，在作物遺傳育種研究和雜種優勢利用等方面發揮了至關重要的作用，為作物雜交育種和雜交種子的生產提供了簡便、高效的途徑。

在主要糧食作物中，水稻細胞質雄性不育系的選育、應用及研究是最深入的［1］。目前，水稻主要有9種CMS不育系，包括野敗（WA）型、K型、矮敗（DA）型、D型、岡（GA）型、印尼水田（ID）型、紅蓮（HL）型、包臺（BT）型和滇（DT）型，其中，WA型、HL型和BT型是生產上應用較多的CMS，對于其細胞質雄性不育和育性恢復的分子機制基本闡明［2-4］。CMS-WA不育系中線粒體不育基因WA352在特定時期的花藥絨氈層細胞中大量積累，與核基因編碼的線粒體蛋白COX11相互作用，抑制COX11在過氧化物代謝中的功能，促進絨氈層細胞的過早程序性死亡和降解，引起花粉敗育［2］。不同的細胞質雄性不育表型是由于不同的線粒體基因組重排產生嵌合基因，擾亂了正常基因的功能，導致雄性配子體異常發育。通過比較分析不育系、保持系和恢復系中線粒體基因組特異的嵌合基因以及其轉錄產物的差異，鑒定出細胞質雄性不育的線粒體基因，如水稻orf79［5-6］、orfH79［7］、WA352［2］和orf182［8］、甜菜orf129［9］、辣椒orf456［10］、芥菜orf220［11］和油菜orf288［12］等。

Stephens于1929年在甜蘇丹草中發現了第一個高粱雄性不育材料，但由于是細胞核控制的雄性不育系，沒能大面積應用于雜交高粱的商業化生產，經過多年的努力，直到1954年，育成了生產上可以利用的第一個高粱細胞質雄性不育系Tx3197A，拉開了高粱雜交育種的帷幕，高粱選育常規品種轉入優良“三系”及其雜交種，極大地提高了高粱的單產［13-14］。根據細胞質類型的不同，目前將高粱核質互作雄性不育系主要分為8種，包括A1、A2、A3、A4、A5、A6、9E 和 KS［15］。張福耀等［16］和侯荷亭等［17］開展了不同類型細胞質不育系育性測交鑒定試驗，結果表明，7種（A1、A2、A3、A4、A5、A6、9E）核質互作不育系雜交的F1育性反應各不相同。

關于高粱線粒體基因組研究以及高粱細胞質雄性不育系中線粒體基因組中不育基因的報道比較少，只在高粱CMS-A3不育系中發現了一個導致細胞質雄性不育的嵌合基因orf107，是由atp9的5'末端和水稻orf79的3'末端共同組成的，能夠轉錄一個18.8 kD的多肽［18］。目前，在生產中應用較多的是CMS-A1和CMS-A2型不育系，但是這兩種不育系細胞質和細胞核基因如何互作以及分別由幾對基因調控都未知［19-20］，其相關的分子遺傳調控機制至今還不清楚。

Tx623A是遼寧省農業科學院1979年從美國得克薩斯農業和機械大學引進的細胞質雄性不育系，具有A1型細胞質，以它作為母本選育出了一批高產、優質、高抗絲黑穗病的雜交種。保持系Tx623B是高粱參考基因組測序的品種，在NCBI數據庫中只有Tx623B的線粒體基因組序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？ term=DQ984518）， 而 沒 有Tx623A線粒體基因組序列。

本研究以CMS-A1型不育系Tx623A和其保持系Tx623B為材料，利用二代結合三代測序技術組裝不育系和保持系線粒體基因組，進一步分析不育系和保持系線粒體基因組的差異以及基因組結構的變異。旨在為A1型細胞質雄性不育基因克隆奠定基礎，也為與其他類型細胞質雄性不育系的比較提供了基因組信息。

1 材料與方法

1.1 材料

Tx623A為CMS-A1型，Tx623B是其對應的保持系。Tx623A和Tx623B均來自遼寧省農業科學院高粱研究所。

1.2 方法

1.2.1 Tx623A和Tx623B全基因組提取 選取籽粒飽滿、均勻一致的種子約100粒，放在墊有三層濾紙的發芽盒中，加入一定量的無菌水，置于人工氣候箱（國產MGC-350HP-2型），16 h光照/8 h黑暗，25℃培養，待兩片子葉完全展開后用于基因組的提取。取大約100 mg新鮮葉片，采用TIANGEN公司植物基因組DNA提取試劑盒（目錄號：DP305）提取總DNA，詳細步驟參考試劑盒操作說明書。

1.2.2 基因組測序及數據質控 使用Illumina Hiseq X測序平臺對樣品進行PE150測序，產生的原始數據（Raw Data）存在一定比例低質量數據，為了使得后續分析的結果更加準確可靠，會對原始的測序數據進行如下處理：（1）去除reads中的adapter序列；（2）去除5'端含有非AGCT的堿基；（3）去除測序質量較低的reads末端（測序質量值小于Q20）；（4）去除含N的比例達到10%的reads；（5）舍棄adapter及質量修剪后長度小于75 bp的小片段。

1.2.3 線粒體基因組組裝 （1）利用blasR將有效數據（Clean data）比對Pacbio三代數據，根據比對結果對單分子測序數據進行一次矯正與糾錯，目的在于減少單分子長序列中單堿基插入缺失的錯誤；最后利用糾正過的單分子測序數據與二代數據進行混合組裝，使用的軟件是SPAdes-3.10.1；挑選覆蓋深度足夠高且組裝長度較長的序列作為候選序列，比對NCBI確認線粒體基因組的Contig序列。（2）將clean reads比對回組裝獲得的Contig，根據reads的paired-end和overlap關系，對組裝結果進行局部組裝和優化，并確定Contig的順序和方向。然后使用Gap Closer（v1.12，http：//soap.genomics.org.cn/soapdenovo.htm）軟件對組裝結果進行內洞修補，得到最終的線粒體基因組序列。

1.2.4 線粒體基因組注釋 使用tRNAscan-SE（http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE） 和 Artemis（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Artemis）識別線粒體的tRNA和ORFs。以高粱線粒體基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？ term=DQ984518）為參考基因組，對蛋白編碼基因和rRNA基因進行同源比對預測，使用的軟件是BLAST+2.7.1，參數默認。然后對同源比對結果去冗余，人工校正基因的首尾及外顯子/內含子邊界，獲得高準確性的基因集。

1.2.5 基因比對數據庫 線粒體的基因蛋白序列，與已知的蛋白數據庫進行blastp比對。由于每一條序列比對結果可能超過一條，為保證其生物學意義，只保留一條最優比對結果作為該基因的數據庫比對信息。常用的數據庫包括：NR（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss-Prot（http ：//www.ebi.ac.uk/uniprot/）、eggNOG（http：//eggnogdb.embl.de/）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/） 和 GO（http ：//geneontology.org/）。

1.2.6 全基因組共線性分析 使用MUMmerv3.23（http：//mummer.sourceforge.net/）軟件對目標基因組和參考基因組進行比對，確定基因組間的大范圍共線性關系。然后使用LASTZ v1.03.54（http：//www.bx.psu.edu/miller_lab/dist/README.lastz-1.02.00/）對區域間進行比對，確認局部位置排列關系，并從中查找易位（Translocation/Trans），倒置（Inversion/Inv）和易位+倒置（Trans+Inv）的區域。

2 結果

2.1 核基因組測序法組裝Tx623A和Tx623B線粒體基因組

為了獲得更加完整、準確的線粒體基因組序列，采用二代和三代測序結合的方法對Tx623A和Tx623B核基因組進行測序，將2次測序數據進行混合組裝，完成對2個樣品線粒體基因組的高質量拼接（表1），Tx623A和Tx623B線粒體基因組大小分別為449 727和452 772 bp，預測到的線粒體基因分別為163個和159個。根據預測Tx623A和Tx623B線粒體編碼基因總長度分別為102 003 bp和99 180 bp，分別占Tx623A和Tx623B線粒體基因組的22.68%和21.91%。

表1 Tx623A和Tx623B線粒體基因組組裝數據統計

2.2 Tx623A和Tx623B線粒體基因組比較

為了探明2個樣品中線粒體基因組的區別，對Tx623A和Tx623B樣品線粒體基因組之間存在的SNP（Single nucleotide polymorphism）和 InDel標記（Insertion and deletion marker）進行比較（表2），在基因內造成同義突變的SNP有9個，非同義突變的SNP有7個；在非基因區間內有差異的SNP共有82個。Tx623B線粒體基因組與Tx623A線粒體基因組相比，在CDS區內，存在InDel差異的有3個；在非基因區域內，存在InDel差異的有6個。

同時也對2個樣品的預測基因進行了詳細的分析比較。在Tx623A中預測的163個線粒體基因中，其中16個基因是兩個拷貝的重復基因，由于在染色體的重復位置不同，故而計為2個基因。除去重復基因，Tx623A線粒體基因組共編碼147個ORFs。Tx623B線粒體基因組中有14個重復基因，因此，Tx623B線粒體基因組共編碼145個ORFs（圖1-A）。通過分析比較Tx623A和Tx623B線粒體基因組中的重復基因，發現其中13個基因是兩者共有的，3個重復基因是Tx623A特有的，1個重復基因是Tx623B特有的（圖1-B）。通過比較分析Tx623A和Tx623B線粒體基因組編碼的147個和145個ORFs，發現139個ORFs是兩者共有的，8個ORFs是Tx623A特有的，6個ORFs是Tx623B特有的（圖1-C）。

表2 以Tx623A線粒體基因組為參考序列的SNP和InDel類型統計

圖1 Tx623A和Tx623B線粒體基因組比較

2.3 Tx623A和Tx623B線粒體基因組共線性分析

根據前人研究報道，細胞質雄性不育與線粒體基因組易位有關，為此，使用MUMmer v3.23軟件對Tx623A和Tx623B線粒體基因組進行共線性分析，發現Tx623A和Tx623B線粒體基因組中存在基因組結構變異（SV）區間（圖2）。其中267 095-324 127（57 032 bp）為Tx623A和Tx623B線粒體基因組中存在的易位區間，該區間共含有22個ORFs（表3）。

圖2 Tx623A和Tx623B線粒體基因組共線性分析

3 討論

植物線粒體基因組大部分由非編碼的DNA序列組成，包含大量重復序列和非編碼RNA插入，研究一直受測序技術發展水平桎梏。近年來，隨著第三代單分子實時測序技術的興起并不斷改進，超長讀長和無偏好性等優勢給植物線粒體基因組組裝提供了新技術支撐。本研究沒有提取高粱線粒體基因組直接測序組裝，而是利用已有的高粱線粒體基因組序列，通過二代和三代測序相結合的方法測核基因組序列來組裝線粒體基因組，為植物線粒體基因組測序組裝提供了新方法。高粱線粒體NCBI上組裝大小為468 628 bp（DQ984518），而利用核基因組測序組裝的線粒體基因組大小為450 kb左右，它們之間相差19 kb左右，這些大小差異主要是非編碼區的差異，更多的是重復序列組裝造成的，編碼區都很保守，而且2個基因組的組裝均成環。水稻線粒體參考基因組在NCBI上公布的由于品種不同，線粒體基因組序列有20多個，大小從400-600 kb均可見，可能都是重復序列造成的差異。

從完成測序的植物線粒體基因組特征來看，高粱與玉米、水稻等線粒體基因組大小較為相近，但高粱含有的基因數與玉米和水稻差別較大，高粱線粒體基因數目為150個左右，而玉米和水稻等植物線粒體基因數目為52-60個［21-22］，而差別的基因多體現在ORFs基因類型上，其他基因類型保守，即使在不育系Tx623A和其保持系Tx623B線粒體基因組也存在ORFs基因類型的差異。高等植物線粒體基因組結構變化很快，重排率比葉綠體基因組高得多，甚至不同亞種之間的線粒體基因組結構差別也很大，存在明顯的分子間和分子內重組。已有研究表明，植物細胞質雄性不育主要是線粒體易位造成的，因此本研究鑒定的易位區間將為高粱A1型細胞質雄性不育基因克隆提供線粒體基因組信息。

對于水稻CMS-WA型不育系如何與核編碼的線粒體蛋白相互作用，導致不育以及如何與CMS的恢復基因相互作用恢復育性等分子機制已經清晰［23-24］。高粱細胞質雄性不育的理論研究遠遠落后于生產應用，雄性不育早在1954年就在高粱雜交育種生產中得到了廣泛應用，目前，關于細胞質雄性不育的研究仍不夠深入，具體不育機理的研究仍很滯后。高粱不同類型CMS的不育機理以及恢復育性機理是否相同，還需要進行深入的研究。本研究高粱A1型細胞質雄性不育系Tx623A及其保持系Tx623B的線粒體基因組比較，為將來解析高粱細胞質雄性不育分子機制奠定了良好的基礎。

表3 Tx623A和Tx623B線粒體基因組結構變異分析

4 結論

通過對高粱CMS-A1型的不育系Tx623A和其保持系Tx623B線粒體基因組比較分析，鑒定出與高粱細胞質雄性不育有關的易位結構區間，具體結論如下。

測序數據組裝拼接后Tx623A和Tx623B線粒體基因組大小分別為449 727 bp和452 772 bp。

Tx623A和Tx623B線粒體基因組分別預測到147個和145個ORFs，其中2個樣品中分別含有特異基因8個和6個。

以Tx623A線粒體基因組為參考序列，Tx623B線粒體基因組中，在基因內造成同義突變的SNP有9個，非同義突變的SNP有7個；82個SNP位于非基因區間內。3個InDel位于CDS區內，6個InDel位于非基因區域內。

Tx623A和Tx623B線粒體基因組中存在57 kb大小的易位結構變異區間，這些結構變異可能是導致Tx623A細胞質雄性不育性的原因。