云斑天牛對不同受害狀態下山核桃揮發物成分的觸角電位和行為反應

馬 艷，史黎央，趙 藝，徐華潮

（1.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州311300；2.陜西省渭南市大荔縣林業局，陜西 大荔715100）

云斑天牛Batocera horsfieldi屬鞘翅目Coleoptera天?？艭erambycidae溝脛天牛亞科Lamiinae白條天牛屬Batocera，又名白條天牛，是在中國廣泛分布的一種豐富且具有破壞性的天牛。幼蟲蛀食活樹樹干的內皮和邊材部分，導致樹容易斷裂，其基本生物學特性與亞科其他天牛相似，生命周期通常在2 a內完成［1］。成蟲出現在初夏，主要以山核桃Carya cathayensis的枝條為食。云斑天牛性成熟，雌雄成蟲交配后，雌蟲將卵存放在寄主樹的樹皮下度過整個夏天。孵化后的幼蟲立即進入內部樹皮，化蛹前至少喂食20個月［2］。據報道，在浙江省杭州市臨安區，多數山核桃被天牛鉆蛀，其種類主要有桑天牛Apriona germari，星天牛Anoplophora chinensis和云斑天牛［3］。云斑天牛幼蟲主要生活在寄主植物樹干內，而成蟲會飛行，鞘翅堅硬且耐藥性強，一般的物理和化學方法很難防控。許多植食性昆蟲利用氣味作為寄主定位的線索，無論是營養、配偶地點還是存放其后代［4-8］。有研究顯示：植物揮發性氣體能引起天牛顯著的行為反應［9-10］。植物揮發性氣體是多種微濃度的揮發性化合物組成的混合物［11］，可以調控天牛取食、產卵和交配等行為［12］。如ZHUGE等［13］發現：云斑天牛可能依賴特定比例的揮發物來尋找定位寄主植物；寄主植物揮發物中的壬醛對云斑天牛有較好的林間誘捕效果［14］。植物在自然狀態、受到天牛攻擊或機械損傷時釋放的揮發物在種類和濃度上存在差異［15］。天牛利用識別植物揮發物的化學成分和相對含量來甄別植物的狀態，進而做出反應［16］，如光肩星天牛Anoplophora glabripennis對受到天牛攻擊后的復葉槭Acer negundo的揮發物有顯著驅避效果，而對健康復葉槭的揮發物有顯著引誘效果［17］。近年來，許多國內外學者通過研究昆蟲和植物揮發物之間的化學聯系，明確昆蟲和植物揮發物互作機制，探究如何利用有益昆蟲或防控有害昆蟲，可以采用類似方法來探索防控云斑天牛的防治方法。本研究運用動態頂空套袋吸附法法收集不同受害狀態下山核桃釋放的揮發物，并通過氣相色譜-觸角電位測量系統（GC-EAD）技術和Y型嗅覺儀技術，檢測能引起云斑天牛顯著電生理和行為反應的揮發物，為篩選云斑天牛的植物源引誘劑或驅避劑的成分和比例提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試植物和蟲源

試驗所用云斑天牛成蟲和山核桃樣樹來自于浙江省杭州市臨安區玲瓏街道雅園村的山核桃苗圃基地（30°12′N，119°38′E， 平均海拔113 m）。 山核桃苗圃基地有少量苦楝Melia azedarach， 林下除雜草外無其他植被，林地地勢較平坦。其中山核桃樹齡5～20年生，樹高為3～15 m，胸徑為8～25 cm，林冠郁閉度約0.5。蟲源利用云斑天牛的假死性進行人工捕捉。

1.2 采用動態頂空采集法收集山核桃揮發物

在山核桃林中隨機選取健康狀態以及被天牛取食、產卵和鉆蛀受害狀態的山核桃（樹齡為5～10年生，樹高為5～15 m，胸徑為10～15 cm）各3株并標記，其中各株樣樹僅1種受害狀。采用活體植物動態頂空吸附法在同一時間收集樣樹不同受害狀態下山核桃釋放的揮發物，采樣6 h（9：00-16：00），重復3次。為消除空氣中的氣體對采集樣品的污染，各種受害狀態設空白對照樣2份。具體的收集方法和步驟參見文獻［18］。

1.3 云斑天牛成蟲對不同受害狀態下山核桃揮發物的觸角電位反應

在中國科學院動物研究所實驗室進行雌、雄云斑天牛成蟲對不同受害狀態下山核桃枝條揮發物洗脫液的觸角電位反應實驗。GC-EAD分析采用Agilent 6890N氣相色譜，色譜柱為HP-5MS，載氣：高純度氮氣，流速1.0 mL·min-1；進樣量2.0 μL，無分流進樣，進樣口溫度 220℃，氫火焰離子檢測器，檢測器溫度280℃。柱溫升溫程序：40℃恒溫1 min，然后以4℃·min-1的速度升溫到220℃恒溫3 min，共運行49 min。測試的樣品為不同受害狀態下山核桃枝條揮發物洗脫液和對照正己烷溶劑，試驗用蟲均為活體，重復5次，GC-EAD與色譜圖上的化合物的峰形和保留時間進行對比，從而鑒定出對雌、雄云斑天牛觸角有觸角電位反應的物質。具體測定方法和步驟參見文獻［18］。

1.4 云斑天牛成蟲對8種標準揮發物的嗅覺反應

據云斑天牛成蟲對不同受害狀態下山核桃揮發物的觸角電位反應，選擇有強烈電生理反應的8種揮發物（表1），用1.0 mL液體石蠟作溶劑將各化合物配制成濃度為1.0 mol·L-1的溶液［19］。Y型嗅覺儀生物測定裝置的規格和嗅覺反應的實驗方法和步驟參見文獻［18］。

表1 8種標準揮發物的名稱、純度和來源Table 1 Name,purity and source of the eight standard volatiles

1.5 數據分析

試驗數據用SPSS 19.0軟件進行統計分析。比較云斑天牛成蟲對不同化合物行為反應的差異顯著性通過卡方檢驗來分析［20-21］，其中選擇率計算公式如下：選擇率＝（氣味臂內的總蟲數或對照臂的總蟲數/測試的總蟲數）×100%。

2 結果

2.1 云斑天牛成蟲對不同受害狀態下山核桃揮發物的觸角電位反應

每種受害狀態選擇1個電生理反應明顯且重復的圖譜（圖1和圖2）。從圖1和圖2可知：云斑天牛雌雄成蟲對不同受害狀態下山核桃揮發物的電生理反應是不同的，其中雌成蟲觸角僅對健康山核桃揮發物中的蒎烯、壬醛、五甲基苯、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應，雌成蟲觸角僅對取食受害的山核桃揮發物中的壬醛、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應，雌成蟲觸角僅對產卵受害的山核桃揮發物中的萜品烯、壬醛、α-萜品醇、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應，雌成蟲觸角僅對鉆蛀受害的山核桃揮發物中的壬醛、α-萜品醇、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應（圖1）；雄成蟲觸角僅對健康的山核桃揮發物中的α-萜品醇、丙烯酸異辛酯及2,6-二甲基萘有電生理反應，雄成蟲觸角僅對取食受害的山核桃揮發物中的萜品烯、壬醛及α-萜品醇有電生理反應，雄成蟲觸角僅對產卵受害的山核桃揮發物中的萜品烯、壬醛、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應，雄成蟲觸角僅對鉆蛀受害的山核桃揮發物中的壬醛、丙烯酸異辛酯、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應（圖2）。

綜上所述，云斑天牛雌雄成蟲觸角僅對蒎烯、萜品烯、壬醛、α-萜品醇、五甲基苯、丙烯酸異辛酯、2,6-二甲基萘及正十六烷有電生理反應。

2.2 云斑天牛成蟲對6種化合物的行為反應

卡方檢驗結果表明：云斑天牛雌雄成蟲對這8種化合物顯示出的行為反應是存在差異的。其中壬醛和α-萜品醇對云斑天牛雌成蟲有極顯著引誘作用（P＜0.01），雌成蟲對這2種化合物的選擇率分別是76.67%和74.44%，而蒎烯對云斑天牛雌成蟲有極顯著的驅避作用（P＜0.01），雌成蟲對其選擇率僅22.22%，其余5種化合物對云斑天牛雌成蟲沒有明顯的行為反應（圖3）；萜品烯、壬醛和α-萜品醇能引起云斑天牛雄成蟲顯著的行為反應（P＜0.05），其中萜品烯和壬醛對其有引誘作用，雄成蟲對它們的選擇率分別是70.00%和73.33%，而α-萜品醇對其有驅避作用，雄成蟲對其選擇率僅27.78%，其余5種化合物不能引起云斑天牛雄成蟲顯著的行為反應（圖4）；雌雄蟲對這8種化合物顯示出的行為反應差別主要是α-萜品醇對雌成蟲有極顯著的引誘作用，而對雄成蟲有顯著的驅避作用。結果表明：引起云斑天牛成蟲觸角產生電生理反應的揮發物不一定會對云斑天牛產生顯著的引誘或趨避作用。

圖1 云斑天牛雌成蟲對不同受害狀態下山核桃釋放的揮發物的觸角電位反應圖譜Figure 1 Electroantennogram responses pattern of female Batocera horsfieldi adults to volatiles released from the Carya cathayensis in different damaged states

3 結論與討論

有報道顯示：植食性昆蟲對不同濃度的同一化合物產生的電生理反應有差異［22］。觸角電位實驗結果表明：云斑天牛成蟲對在不同受害狀態下山核桃釋放的揮發物中的蒎烯、萜品烯、壬醛、α-萜品醇、五甲基苯、丙烯酸異辛酯、2,6-二甲基萘及正十六烷8種揮發物產生顯著的電生理反應，但云斑天牛成蟲對不同受害狀態下山核桃中這8種揮發物存在不同的電生理反應。這可能是因為這8種揮發物雖在不同受害狀態下山核桃揮發物中都存在，但比例和濃度不同。

卡方檢驗結果表明：壬醛和α-萜品醇對云斑天牛雌成蟲均存在極顯著引誘作用（P＜0.01），萜品烯和壬醛對云斑天牛雄成蟲產生顯著引誘作用（P＜0.05）；而蒎烯對云斑天牛雌蟲產生極顯著驅避作用（P＜0.01），α-萜品醇對云斑天牛雄成蟲產生顯著驅避作用（P＜0.05）。張冬勇［14］報道，壬醛引起云斑天牛產生顯著的電生理反應，將其作為誘芯時誘捕到了云斑天牛；且YANG等［23］報道中m（順-3-己烯醇）∶m（壬醛）∶m（三氯乙烯）∶m（β-月桂烯）=57∶15∶17∶11 引起云斑天牛產生最強的電生理和行為反應，其中壬醛是混合物的一種成分。

圖2 云斑天牛雄成蟲對不同受害狀態下山核桃釋放的揮發物的觸角電位反應圖譜Figure 2 Electroantennogram responses pattern of male Batocera horsfieldi adults to volatiles released from the Carya cathayensis in different damaged states

圖3 云斑天牛雌成蟲對8種標準揮發物的行為反應Figure 3 Behavioral responses of female B.horsfieldi adults to eight standard volatiles

圖4 云斑天牛雄成蟲對8種標準揮發物的行為反應Figure 4 Behavioral responses of male B.horsfieldi adults to eight standard volatiles

云斑天牛雌雄成蟲對揮發物的電生理和行為反應有差異。據報道：天牛在定位寄主時主要通過觸角上的感受器來識別寄主植物［24］，說明這可能是天牛觸角的性二型導致的差異。TOOKER等［21］研究發現：香草烯不能引起黃峰Antisrophus rufus顯著的行為反應，但它可以加強其他揮發物的作用，說明植物揮發物中某一揮發物本身不能引起植食性昆蟲顯著的引誘或趨避反應，但其存在可能會加強或遏制其他揮發物的作用。如嗅覺反應實驗中的五甲基苯、丙烯酸異辛酯、2,6-二甲基萘和十六烷，雖不能引起云斑天牛產生顯著的行為反應，但其作用不容忽略，在后期的研究中需加以重視。

供試天牛是從野外人工捕捉的，無法確保天牛成蟲蟲齡的完全一致，這可能會對實驗結果產生一定的影響，因為不同蟲齡的天牛成蟲對揮發物的反應可能不同。天牛對植物化學指紋圖譜（chemical fingerpint）［25］的識別是極其復雜的，研究單一揮發物對云斑天牛的作用僅是第一步，還需要進一步的研究，即將不同有效成分按特定比例混配進行嗅覺反應實驗和林間誘捕試驗。