高原型青海藏羊超數排卵效果分析

文│隋鶴鳴 孟飛 許海濤 朱芳賢（全國畜牧總站）

莫延新 謝秀梅（青海省家畜改良中心）

高原型青海藏羊是經過青藏高原牧民長期選育的特色地方品種山羊。此品種適應性強、抗病力強、耐粗飼而且肉質優良，是當地肉類主要來源。為了避免在未來發展過程中，出現雜交、近交、環境變化等造成的優良基因流失問題，開展了青海良種高原型青海藏羊保種胚胎收集保存工作。冷凍胚胎保存可以保存品種個體的全部基因。胚胎細胞可以長期存活于超低溫條件，可以通過胚胎移植和核移植技術恢復遺傳資源，因此，在保護動物遺傳資源，尤其是挽救瀕危動物方面，冷凍胚胎技術發揮了重要的作用。

一、材料與方法

1.供體羊。從主產區挑選純種12～36月齡高原型青海藏羊在青海省家畜改良中心西寧示范基地開展。

2.主要藥品與器械。日本（JP）FSH（促卵泡素），10AU×5支；加拿大（CAN）Follitropin FSH，每支400毫克；氯前列烯醇（PG），每支0.2毫克/2毫升；促黃體素釋放激素A3（促排3號），20微克×10支；普魯卡因每支40毫克/2毫升；黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），每支1.9克。

羊用二通式沖卵管、滯留針、集卵杯、手術器械、恒溫水浴鍋、體視顯微鏡、自制手術保定架。

3.供體超數排卵處理方案。供體超數排卵處理方案見表1，各試驗組埋置CIDR和配種后各注射維生素ADE注射液3毫升和促排3號3/4支。

4.供體羊配種。觀察到第1次發情12小時后配種，之后間隔10～12小時再配一次，連續配種2～3次。

5.胚胎的采集與質量鑒定。以發情日為第0天，第7天采用手術法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩側子宮角，每側用液20毫升。子宮回流液靜置3分鐘，在顯微鏡下撿出卵子，并保存在保存液中。根據形態學標準進行胚胎分級，通常有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C級胚胎，根據保種需要，本文中有效胚胎為A、B級胚胎。分級標準如下：

A級：胚胎形態完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結構緊湊，色調和透明度適中，無附著的細胞和液泡，變性細胞少于15%。

B級：輪廓清晰，色調及細胞密度良好，可見到少量附著的細胞和液泡，變性細胞少于50%。

C級：輪廓不清晰，色調發暗，結構較松散，游離的細胞或液泡較多，變性細胞少于75%。

D級：凡在16細胞以下的受精卵，或有碎片、輪廓不清晰、結構松散、變性細胞達75%以上都屬于D級。

6.數據處理。采用SPSS 17.0軟件試驗數據進行統計分析，試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用單因素方差分析對各組數據進行差異顯著性分析。超數排卵有效但沖卵失敗的個體不計入數據分析。

二、結果與分析

1.高寒地區高原型青海藏羊超數排卵效果。超數排卵處理37只高原型青海藏羊，有效沖胚34只，結果表明為只均黃體數7.84個，只均獲有效胚3.43 枚。

2.日本FSH不同劑量超數排卵效果的比較。日本FSH不同劑量超數排卵效果見表2，日本FSH不同注射量中Ⅱ組（20.0AU）效果最佳，只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）、受精率分別為5.94個、4.06個、68%、2.33枚、57%和85%。Ⅰ組只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率高于Ⅱ組（P＞0.05），但由于其參試供體少，我們認為效果總體評價不如Ⅱ組。Ⅲ組只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均有效胚數、有效胚率低于Ⅱ組（P＜0.05），受精率也低于Ⅱ組（P＞0.05）。

表1 超數排卵處理方案

3.加拿大FSH不同劑量超數排卵效果的比較。加拿大FSH不同劑量超數排卵效果見表3，加拿大FSH不同注射量中Ⅱ組（240毫克）效果最佳，只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率、受精率分別為10.33個、8.33個、81%、5.67枚、68%和79%。Ⅰ組卵子回收率、有效胚率、受精率高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均黃體數、只均回收卵數、只均有效胚數低于Ⅱ組（P＞0.05），我們認為效果總體評價不如Ⅱ組。Ⅲ組只均黃體數高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率低于Ⅱ組（P＞0.05），受精率顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。

4.不同品牌F S H超數排卵效果的比較。不同品牌F S H超數排卵效果見表4，比較了效果最佳的日本FSH20.0AU組與加拿大FSH240毫克組，加拿大FSH只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率都顯著高于日本FSH（P＜0.05），只有受精率低于日本產FSH（P＞0.05），此次試驗中加拿大FSH效果優于日本FSH。

表2 日本FSH不同劑量超數排卵效果的比較

三、討論

1.高寒地區高原型青海藏羊超數排卵效果分析。超數排卵對于供體來說是一個復雜的生理過程，超數排卵處理方法要根據供體本身激素水平的變化而設計，但因不同品種、不同個體、不同藥品和不同生長環境，其處理方法也不相同，超數排卵結果也不一樣。朱士恩總結了我國2010年以前綿羊超數排卵結果發現，美利奴超細毛羊超數排卵獲得可移植胚胎數量平均為5.83～6.56枚/次，肉用綿羊為6.98～9.77枚/次。但有關地方品種綿羊超數排卵的報道少，尤其是高海拔、高寒地區。

由于生態環境和品種的差異，超數排卵結果差異也很大，朱芳賢等（2014）報道蘭州大尾羊獲得A級胚胎平均為5.0枚/次。此次試驗只均黃體數只有7.84個，只均獲有效胚只有3.43枚，可能原因，一是高寒地區藏羊繁殖率低，母羊一般年產一胎，一胎一羔，產雙羔者很少。二是此實驗供體羊都是放牧，超數排卵處理過程中應激大，影響超排效果，最明顯的影響是試情時躲閃，無法判斷準確發情時間。配種時不穩，精液不到生殖道或到的少。三是供體羊有的剽悍，采食過多，群體中肥瘦分化大。建議馴養一段時間后開展超數排卵工作，同時注意分群飼養。

2.FSH不同劑量超數排卵效果的比較。適宜的FSH劑量是取得好的超數排卵效果的關鍵因素之一。較大的劑量造成較強的激素應答反應，劉廣振認為較強的激素應答反應使得部分個體優勢卵泡排卵過早，黃體功能不全，分泌孕酮水平較低，從而造成胚胎退化。譚景和等、范必勤等也認為較強的激素應答反應使得卵巢過度增大，卵泡過度增多，可能卵母細胞質量下降，排卵后卵子未進入輸卵管中而直接掉入腹腔，最終卵子回收率低，未受精卵多，可用胚率也很低，A、B級胚胎更少。本次試驗中日本FSH大劑量24.0AU組、加拿大FSH劑量280毫克組都是卵泡發育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子質量差，造成受精率低和胚胎退化的多。本次試驗證實了以上說法，同時也說明，高原型青海藏羊適宜FSH劑量為20.0AU的日本FSH和240毫克的加拿大FSH。

3.不同品牌FSH超數排卵效果的比較。超數排卵是應用不同品牌、不同批次的激素也是影響超數排卵效果的主要因素之一。桑潤滋等認為，不同品牌、不同批次的激素是存在質量差異和效價不穩定等因素，純度及所含促黃體素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品種、不同個體超數排卵效果也不相同。本次試驗中加拿大FSH超數排卵效果優于日本產FSH，說明加拿大FSH更適合高原型青海藏羊，但造成這樣的原因可能是不在同一期進行，受營養等因素影響，建議大規模進行超數排卵前有必要做些預試驗。

四、小結

本試驗超數排卵處理37只高原型青海藏羊，結果表明：只均黃體數7.84個，只均獲有效胚3.43枚，同時也表明，日本FSH的適宜劑量為20.0AU，只均黃體數5.94個，只均獲有效胚2.33枚；加拿大FSH的適宜劑量為240毫克，只均黃體數10.33個，只均獲有效胚5.67枚；加拿大產FSH效果優于日本產FSH，差異顯著，說明加拿大FSH更適合高原型青海藏羊，同時建議大規模進行超數排卵前有必要做些預試驗。

表3 加拿大產FSH不同劑量超數排卵效果的比較

表4 不同品牌FSH超數排卵效果的比較