紫草中紫草素及衍生物的分離研究

陳江龍

【摘 要】本文紫草中紫草素及衍生物的分離研究中運用硅膠柱層析法進行分離，采用了300-400目硅膠填充料，設置4cm×27cm的層析柱徑高比，萃取出石油醚液提，進行濃縮，將硅膠混勻，得到石油醚與乙酸乙醋的洗脫溶劑，采用3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。運用高效液相色譜法，得出紫草素及其中的5種衍生物，分別是紫草素、異戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-輕基異戊酞紫草素等四種化合物。

【關鍵詞】紫草中紫草素；衍生物；分離研究

紫草中主要生物活性成分有蔡釀類化合物，包括β-乙酞氧基異戊酞紫草素、紫草素、乙酞紫草素、β-β二甲基丙烯酞紫草素、異戊酞紫草素等，紫草具有良好的增強免疫力、抗炎、抗癌、降血糖、護肝、抗菌、抗生育等多多種功效。屬于一種天然食用色素，紫草素類化合物能夠有效抑制血小板活化因子、骨膠原、兔血小板凝聚、花生四烯酸等。單菇苯醒與單菇苯酚能夠有效抑制體外前列腺的生物合成，屬于我國傳統的中藥之一，對其進行人工種植培育以及衍生物的分離研究具有重要的應用前景。

一、實驗

（一）實驗材料與實驗儀器

本次研究選用的是從黑龍江哈爾濱三棵樹藥材市場采購的新疆紫草藥材，經過權威機構鑒定為屬于新疆紫草的干燥根莖。實驗試劑包括實驗室自制的去離子水，中國藥品生物制品檢定所的紫草素對照品，以及甲醇與色譜純。選用的實驗儀器有美國Waters公司的Waters高效液相色譜儀，上海玻璃儀器廠的M-50型玻璃過濾器，北京Sartorious有限公司的BS210S電子天平，日本島津公司的UV-2550紫外一可見分光光度計，江蘇常熟長青儀器儀表廠的DT200A電子天平。

（二）實驗方法

將甲醇加入到紫草素對照品之中制成0.4182mg/ml的溶液，以其作為對照品貯備液。將其加入到不同容量的溶液之中，加入甲醇進行定容，得出對照品的溶液。

制備樣品溶液，選取10g干燥紫草根粉末，將100ml90%的乙醇溶液加入其中并進行3min的勻漿處理，之后使用漏斗進行抽濾處理，樣本溶液即濾液，對樣本溶液采用避光冷藏保存方式。測定提取液中紫草素含量，將1ml液計量體積進行稀釋之后得出適宜的溶液，進行離心處理，采用的離心條件是25℃的離心溫度，設置12000r/min的速度，進行5min的離心處理，對上清液進行3次檢測，在55℃的溫度環境下對剩余的溶液進行濃縮稱重，計算其中的浸膏純度。

選取10.0g絕干條件下的新疆紫草原料，對其進行超聲、回流、微波、冷浸以及超臨界CO2萃取，對液回收溶劑進行充分提取，在50℃環境將溶劑除去，計算樣本中的得率與純度。在提取時間增加的情況下，紫草素得率也在隨之增加，同時起純度也呈現出下降趨勢，一般以3-5min的提取時間為宜。

二、紫草中紫草素及衍生物分離實驗方法

（一）硅膠柱層析分離純化紫草素衍生物

首先裝柱，將300-400目硅膠在充分浸泡之下形成糊狀，之后沿著層析柱壁逐層攪拌，設置1滴/秒的攪拌速度，確保將硅膠柱壓實，并將其中的氣泡趕盡，設置4cm×27cm的層析柱徑高比。

之后上樣，在60-90℃沸程下，以石油醚6次萃取1000ml紫草80%乙醇勻漿提取液，并將其合并成石油醚萃取液，在50℃的溫度環境下，將溶液壓縮至50ml，并將10g300-400目硅膠加入其中，在層析柱表面上將拌有紫草提取物的硅膠鋪在其上，設置2cm的鋪層厚度。

之后是洗脫處理，在一定的流速之下，將不同配比的溶劑體系進行洗脫處理，結合時間判斷流處于的具體體積，并在固定的時間內對其進行HPLC檢測，在石油醚：乙酸乙酷比例上設置一定的梯度進行洗脫處理，設置3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。在流出紫草素衍生物時，將產品段進行充分收集，在HPLC檢測下沒有樣本的情況下停止收集。并將收集到的紫草素衍生物洗脫液合并，并對其進行高效液相檢測，之后對部分樣品進行LC-MS檢測。

（二）運用高效液相色譜一質譜聯用儀

1.色譜設置條件

本次研究中采用高效液相色譜方法檢測，即HPLC，將流動相：甲醇：水：乙酸之間的比例設置為82：17.5：0.5，設置5μm，4.6mm×250mm Kromasil C18的色譜柱，設置25℃的室溫，設置1.0ml/min的柱溫，設置10μL的進樣量，以及516nm的檢測波長。

2.采用結晶法純化紫草素

對50ml紫草乙醇提取液，將其中的乙醇回收至剩余量的20ml，之后將20ml水加入至其中。之后以50ml為限萃取3次石油醚萃，并將三次萃取結果合并，計算三次的共同體積，之后萃取三次等體積的0.2mol/LNOH，并將1mol/L的H2SO4溶液加入其中，促進其反應直至溶液顏色從藍色變成紅色，其中的hH值變成5-6，在室溫之下攪拌兩小時，直至能夠從溶液中析出紅色固體物質，之后對溶液進行過濾、水洗，并在50℃的真空條件下干燥。選取其中一定量的樣本進行溶解，對樣本中所含有的紫草素含量進行測量。

三、實驗結果

（一）采用硅膠柱層析分離純化紫草素衍生物結果分析

采用硅膠柱層析法得到的紫草素及其衍生物中的色譜圖具體如下圖1所示。

圖1 紫草素及其衍生物中的色譜圖

按照色譜實施的條件對硅膠柱層析法中得出的紫草素及其蔡醒類衍生物單體進行色譜檢測，分析各個不同單體成分中的分子量，并對色譜結果進行分析，能夠得出化合物中的物Ⅰ表示紫草素，Ⅱ表示β、輕基異戊酞紫草素，Ⅲ表示乙酞紫草素，Ⅳ表示異戊酞紫草素，同時化合物中的Ⅳ與Ⅴ成分在此次試驗結果下尚難以充分確定。

（二）結晶法純化紫草素的結果

按照實驗操作步驟，采用結晶法純化紫草素，在此次實驗中得到了15mg的紅色紫草素固體，通過對其進行檢測之后，得到90%以上的紫草素純度。

四、結束語

本文運用硅膠柱層析法分離紫草素衍生物過程中設置了4cm×27cm的層析柱徑高比采用了300-400目硅膠填充料，將石油醚萃取液提取出之后，對其進行一定濃縮，并將其與定量的硅膠充分混勻，之后得到不同不同體積比石油醚與乙酸乙醋的洗脫溶劑，設置3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。在高效液相色譜法的運用之下，得出紫草素及其中的5種衍生物并對其采用液相-質譜檢測，得出紫草素、異戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-輕基異戊酞紫草素等四種化合物。

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