超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物肌肉組織中6種氨基糖苷類藥物殘留

鐘名琴，黃 婷，吳雯娟，羅 燕*，丁燕玲

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518000）

氨基糖苷類藥物（AGs）是一類含有氨基糖苷鍵的廣譜性抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有較強的抗菌活性[1]。近年來，由于其高效、低價，在畜牧獸醫領域中常用于治療細菌感染病，以亞劑量給藥預防疾病。此外，在畜禽、水產養殖業也常添加到飼料中促進動物生長發育，以提高飼料利用。AGs對動物組織具有很強的親和力，給藥后多天仍可在動物體中檢測出藥物殘留，長期高劑量使用藥物會對動物產生蓄積毒性，甚至通過食物鏈作用傳遞或其他渠道攝入人體中，對人體和動物造成危害，產生腎毒性、聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感等耳毒性和神經肌肉阻滯等[2-3]。為保障食品安全，歐盟明確規定禁止使用AGs作為畜禽促生長添加劑，美國食品藥品監督管理局（FDA）及許多國家和機構明確規定了該類藥物在食品中的最大殘留限量要求。我國也加強了對動物源性食品中該類藥物的殘留監控，如農業部公告第235號規定鏈霉素/雙氫鏈霉素在肌肉中的最大殘留限量為600 μg·kg-1。

目前，國內外檢測該類抗生素的方法主要有微生物法、分光光度法、免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法等[4-8]。其中，液相色譜-串聯質譜法是檢測該類抗生素應用較廣泛的方法[9-12]。動物源性食品基質復雜，文獻報道的檢測方法大多檢測周期長，樣品前處理過程繁瑣，基質效應嚴重，甚至需要衍生化處理等，這給目標物的快速定性、準確定量檢測帶來較大困擾。

本試驗對樣品前處理方法和質譜條件進行優化，建立具有高靈敏度、高選擇性的UPLC-MS/MS法同時快速準確定性、定量檢測動物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B等6種氨基糖苷類藥物。該方法操作簡便，能大幅縮短檢測周期，靈敏度高，還能有效避免七氟丁酸等離子對試劑造成的儀器污染及離子抑制等問題，為動物源性食品中氨基糖苷類藥物監控提供快速、準確可靠的定性和定量技術。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500質譜儀（美國AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自動氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機、Milli-Q Integral3型超純水儀、奧特賽斯AS系列超聲波清洗機、Waters HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱。

1.1.2 藥品與試劑

甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、異丙醇（色譜純）、三氯乙酸（分析純）、氨水（優級純）等。

鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素、潮霉素B：純度高于90.0%，均為德國Dr.Ehrenstorfer公司產品。

1.2 樣品制備

取適量新鮮豬肉組織，充分絞碎且均質，于-20℃避光保存。

1.3 標準儲備液和混合標準工作液的配制

準確稱取鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素、潮霉素B的標準品，分別用水溶解并稀釋成濃度為1.00 mg·mL-1的標準儲備液，4℃避光保存6個月。再分別移取適量上述各物質標準儲備液用水逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液，現配現用（AGs易吸附于玻璃制品上，實驗過程中應盡量使用塑料制品）。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

準確稱取經均質的豬肉樣品2.0 g（精確至0.01 g），置于50.0 mL離心管中，加入5%三氯乙酸溶液5 mL，渦旋30 s，于水平振蕩器上振蕩提取15 min，9 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。再加入5 mL 5%三氯乙酸溶液重復操作1次，合并上清液，用甲酸或氨水調節pH為6.5±0.5，備用，凈化前9 000 r·min-1離心5 min。

1.4.2 凈化

取全部上清液10.0 mL以1滴·3 s-1流速過依次用5 mL甲醇和3 mL水活化的HLB固相萃取柱（規格：6cc 200 mg），用水3 mL淋洗，減壓抽干。再以流速1滴·3 s-1用甲酸/異丙醇/水溶液2 mL（10∶5∶85，v/v/v）洗脫入塑料離心管中，過0.22 μm微孔濾膜，上機測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動相A為甲酸銨溶液200 mmol（pH 3）；流動相B為乙腈（色譜純）；柱溫40.0℃；進樣體積5.0 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi；霧化器壓力：55.0 psi；輔助加熱器壓力：55.0 psi。

保留時間、定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。空白基質分別添加1 000 μg·kg-1鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B藥物的色譜圖見圖1。

表2 質譜參數

圖1 空白樣品中添加1 000 μg·kg-1氨基糖苷類藥物的色譜圖

2 結果與討論

2.1 標準曲線

準確稱取6個空白豬肉樣品經上述樣品前處理方法處理，獲得空白樣品提取液。分別用空白樣品提取液配制鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素混合外標濃度為50.0、100.0、300.0、500.0、1 000.0和1 500.0 ng·mL-1系列標準曲線及潮霉素B外標濃度為100.0、300.0、500.0、1 000.0、1 500.0和2 000.0 ng·mL-1系列標準曲線，供液相色譜串聯質譜測定。鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B基質試驗峰面積與相應回收濃度的線性關系良好，其相關系數分別為0.992 7、0.994 2、0.997 4、0.997 8、0.998 1、0.998 7，見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣品為基質，做7個平行添加試驗，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素的陽性添加濃度均為20.0 μg·kg-1，潮霉素B陽性添加濃度為100 μg·kg-1，按照上述樣品前處理方法全過程進行預處理和測定，平行樣本n=7。根據各樣本檢測值計算出平均值X及標準偏差Sb，按公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（k為置信因子，一般取3）計算，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B檢測限分別為5.3、6.9、6.5 、2.9、4.1和1.7 μg·kg-1，結果見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗證

用空白基質樣品分別對鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素進行20.0、100、500 μg·kg-1及潮霉素 B 進行 100、200、1 000 μg·kg-13個水平的添加回收實驗，每個水平取6個平行樣，按1.2.3中的方法進行處理，供液相色譜串聯質譜測定。其平均回收率和相對標準偏差結果見表4。

表3 標準溶液線性參數

表4 方法加標回收率和相對標準偏差（n=6）

續表4

由表4可知，該方法的回收率較好，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的回收率范圍分別為80.6%～96.9%、93.8%～102.0%、72.4%～104.0%、84.8%～99.5%、80.6%～99.0%和78.8%～97.9%，方法檢出限低、重復性好、定性可靠、定量準確，能穩定提取豬肉中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B，并且峰形受基質的干擾比較小。

3 結論

本方法建立了動物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。試驗結果表明，該方法檢出限低、回收率較好、靈敏度高。通過優化實驗過程及儀器參數，該方法簡單、快捷、易操作，可大幅縮短檢測時間和節約人力物力，能有效消除基質干擾，適用于動物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的準確定性、定量檢測。