外生菌根菌對油松幼苗抗氧化酶活性及根系構型的影響

祁金玉,鄧繼峰,尹大川,蔡立新,劉冬萍,張麗麗,林 梅

沈陽農業大學林學院, 沈陽 110866

油松(Pinustabulaeformis)為中國特有樹種。它適應性強,根系發達,耐干旱耐瘠薄,是我國北方地區最主要造林樹種[1],依賴菌根來吸收水分和養分以適應不良的環境條件[2- 3]。外生菌根具有促進油松生長,增強油松抗逆性的作用[4- 6]。

植物根系將植物固定在土壤中支撐著植物的地上部分,是植物吸收水分和養分的主要器官,根系的空間分布特征對其吸收水分養分的能力、根系生物量/根系生產力和根系動態變化有重要影響[7-8]。外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi；簡稱ECMF)侵染植株根系后,增加了植株根系的適應性,拓寬了植株獲取營養的渠道。吳小芹等[9]研究接種黃色須腹菌(Rhizopogenluteous)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)和美味牛肝菌(Boletusedulis)均能增加黑松(P.thunbergii)根系直徑、吸收根的分布范圍等根系參數。翟帥帥等[10]研究褐環乳牛肝菌(S.luteus)接種馬尾松顯著增加了馬尾松根系總長度、表面積、體積等根系參數,擴展了根系分布范圍。目前對油松根系的研究,主要有不同光照、施用有機碳肥等條件下油松根系變化情況,以及建立油松根系的三維靜態模型[11- 13]。對于不同種類的外生菌根真菌接種后油松幼苗根系構型報道較少。

本研究通過對油松接種褐環乳牛肝菌(S.luteus)和紅汁乳菇(L.hatsudake),以期促進油松幼苗苗高地徑的增長,提高苗木理化性質,探討兩種ECMF對油松根系構型的促生效應,為培育優良的油松菌根苗木,提高造林成活率,提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油松種子由撫順林業局提供。供試菌種：紅汁乳菇(L.hatsudake)吉林農業大學惠贈；褐環乳牛肝菌(S.luteus)分離自遼寧省彰武縣章古臺實驗林場。

1.2 試驗準備

種子催芽：2016年4月20日播種,選取大小一致的油松種子,預先用0.5%高錳酸鉀消毒30 min,無菌水沖洗數次后,用滅菌濕紗布包裹保濕,置于25℃人工氣候箱中催芽,每天早、晚用無菌水各沖洗1次,直至出芽。

無菌土制備：試驗用盆為營養缽(15 cm×12 cm×13 cm)。缽內預先裝入121℃下高溫高壓滅菌2 h的混合土(草炭土∶蛭石∶河沙=2∶1∶1),每盆土量重約500 g。

菌劑制備：用直徑5 mm的無菌打孔器,切取在平板培養基上培養好的褐環乳牛肝菌、紅汁乳菇,分別接種于盛有250 mL PD液體培養基(配方：葡萄糖20 g,馬鈴薯200 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,H2O 1000 mL)的三角瓶中,每瓶接種3片菌餅。置于搖床上(25℃、160 r/min)振蕩培養,得到液體菌劑。使用前按照菌劑和水體積為1∶3的比例混合,用攪碎機將菌絲體攪碎做勻漿處理,備用。

1.3 試驗設計

試驗設置3種處理方式：

處理1：接種無菌PD培養基(CK)；

處理2：接種紅汁乳菇(LH)；

處理3：接種褐環乳牛肝菌(SL)。

待幼苗成活定株后,采取打孔灌根接種的方式接種紅汁乳菇和褐環乳牛肝菌,每盆接種50 mL菌劑。CK施以等量無菌PD培養基。每個處理10次重復,每盆5株苗,共30盆,150株苗。

1.4 測定方法

1.4.1菌根侵染率

在苗木生長4個月后,每處理隨機挖取油松幼苗10株,在體式鏡下觀察菌根形態,測定菌根侵染率。

外生菌根侵染率采用統計計算法。將根樣剪成1 cm等長的根段,隨機選取根樣,每樣100個根段,在體視鏡下觀察外生菌根侵染率。

1.4.2苗木生長指標測定

每處理隨機取樣10株,輕輕抖掉表面土,流水沖掉根部附著土,用卷尺和游標卡尺分別測量植株的苗高、地徑；用吸水紙吸干水分電子天平稱取鮮重,80℃烘干至恒重稱取干重。

1.4.3苗木抗氧化酶活性

分別選取不同處理油松苗相同部位針葉和根系取樣,利用南京建成試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性。

1.4.4苗木根系參數測定

根系生長：掃描儀對不同處理的根系進行掃描、分級。用萬深LA-S植物根系分析系統對根系長度、投影面積、表面積、體積、平均直徑、根尖數、分枝數、交叉數等指標進行分析。

根系空間構型：測定一級側根與主根的夾角,根據吳小芹[11]方法將一級側根分為3類(Ⅰ：<60°側根；Ⅱ：60°—80°側根；Ⅲ：80°—90°側根),計算各類角度側根占一級側根總數的比例。

1.5 數據統計

數據用SPSS進行單因素差異顯著性分析,α=0.05,并用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 油松幼苗的菌根侵染率及形態觀察

油松幼苗菌根侵染率見表1,菌根形態見圖1。由表1可知,兩種外生菌根菌均能與油松形成外生菌根,其中褐環乳牛肝菌與油松菌根合成率最高為68.62%,紅汁乳菇與油松菌根合成率為62.12%,二者差異不顯著。

褐環乳牛肝菌與油松可形成棒狀和二叉狀分支的菌根；紅汁乳菇與油松形成的菌根中只觀察到棒狀菌根。形成菌根的苗木根系前端有膨大增粗,呈盾圓形。對照未形成菌根根系前端平齊。

圖1 形成菌根形態(20×)Fig.1 The formation of mycorrhizal synthesis(20×)CK：對照Control check；LH：紅汁乳菇Lactarius hatsudake；SL：褐環乳牛肝菌Suillus luteus

2.2 不同外生菌根菌對油松幼苗生長的影響

對照油松生長纖細,針葉稀疏,接種紅汁乳菇和褐環乳牛肝菌處理油松幼苗生長健壯,針葉較對照茂密,其中接種褐環乳牛肝菌油松針葉尤其茂盛。

接種處理均能顯著提高油松的苗高、地徑；地上和地下部分的鮮重、干重。不同接種處理只有地徑差異不顯著(P>0.05),接種褐環乳牛肝菌相比接種紅汁乳菇的苗木苗高增加12.17%；地上和地下部分的鮮重增加37.68%、60.68%;地上和地下部分的干重增加40.11% 、61.64%。

表1 不同處理對幼苗生長的影響

CK：對照Control check；LH：紅汁乳菇Lactariushatsudake；SL：褐環乳牛肝菌Suillusluteus

2.3 不同外生菌根菌對油松幼苗抗氧化酶活性的影響

不同處理油松幼苗抗氧化酶活性見表2。接種外生菌根菌的油松幼苗針葉和根系SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性均大于不接種處理,經方差分析接種處理與對照CK存在顯著差異。接種褐環乳牛肝菌幼苗針葉的抗氧化酶活性均大于接種紅汁乳菇幼苗,其中SOD活性比接種紅汁乳菇的高14.77%,POD活性高20.77%,CAT活性高34.68%；根系中抗氧化酶活性也均大于接種紅汁乳菇幼苗,分別高出8.54%,4.34%,33.31%。

表2 不同處理對幼苗針葉和根系抗氧化酶活性的影響/(U g-1s-1)

2.4 不同外生菌根菌對油松幼苗根系構型的影響

2.4.1根系參數

不同處理根系生長參數測定結果見表3。接種處理顯著提高了油松根系長度、表面積、體積、平均直徑、根尖數、分叉數。接種褐環乳牛肝菌和紅汁乳菇處理與對照相比,根系長度分別增加12.82%和19.15%；表面積分別增加70.37%、69.81%；根系體積分別增加92.34%、92.61%；根系平均直徑均增加66.67%；根尖數分別增加92.24%、88.13%；分叉數分別增加79.29%、80.41%。

表3 不同處理幼苗根系生長參數

2種接種處理根系參數中根系長度增加幅度較小,在10.00%—20.00%之間；其余指標均增加60.00%以上。方差分析表明接種處理與對照均存在顯著差異,兩種接種處理間只有根尖數存在顯著差異,其他根系參數指標均差異不顯著。

2.4.2油松不同菌根幼苗根系空間構型

不同處理油松幼苗的根系分布情況見圖2、圖3。

圖2 不同處理油松根系形態Fig.2 Pinus tabulaeformisroot morphology under different treatments

圖3 油松不同外生菌根苗木根系不同角度一級側根所占比例 Fig.3 The occupation of primary lateral roots in the different angle of branch under different the mycorrhizal inoculation

由圖2可見接種褐環乳牛肝菌的油松根系構型明顯優于接種紅汁乳菇和對照。由圖3可見接種褐環乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側根占23.81%,60°—80°的一級側根占16.65%,<60°的一級側根占59.54%；接種紅汁乳菇幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側根占13.3%,60°—80°的一級側根占17.34%,<60°的一級側根占69.36%；對照幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側根僅占2.41%,60°—80°的一級側根占4.91%,<60°的一級側根占92.68%。其中褐環乳牛肝菌80°—90°的一級側根最多,紅汁乳菇次之,對照根系中所占比例最少,因而接種褐環乳牛肝菌幼苗的根系沿根圍不同方向生長范圍最廣,對照根系中80°—90°的一級側根少,限制了根系的橫向生長。

3 結論與討論

研究結果表明,在實驗室條件下選用的兩種外生菌根菌均能與油松合成典型的外生菌根,菌根侵染率超過60%。低于劉強[14]褐環乳牛肝菌與油松的菌根合成率和翟帥帥等[10]褐環乳牛肝菌與馬尾松菌根合成率,這可能是因為不同采集地點菌株差異、不同寄主植物間差異或菌劑施用濃度的差異。褐環乳牛肝菌與油松主要形成棒狀和二叉狀菌根；紅汁乳菇與油松主要形成棒狀菌根,試驗中未觀察到其他形態菌根。研究結果同時表明,兩種外生菌根接種處理均顯著提高了油松幼苗的苗高、地徑、干重、鮮重。

CAT、POD 和 SOD 是植物體內主要的抗氧化酶系,通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性[15]。SOD作為植物抗氧化系統的第一道防線在生物體中普遍存在,它將超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫,控制細胞膜脂過氧化,接著由 CAT 和 POD 立即將過氧化氫分解為無害的水[16- 17]。在正常的條件下,植物體內酶彼此協調,防御系統中酶的活性高低就成為控制傷害的決定因素,也能較好地反映植物對逆境的適應能力[18]。本研究中接種外生菌根油松幼苗的針葉和根系3種抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性顯著高于不接種處理,兩種外生菌根菌處理間褐環乳牛肝菌針葉和根系抗氧化酶活性均高于紅汁乳菇處理,其中只有根系POD活性間無顯著差異,其余均具有顯著差異。

生長指標可以直接評價苗木生長的好壞程度。油松接種兩種外生菌根菌后,苗高、地徑等生長指標有了顯著提高,說明選用的兩種外生菌根菌均具有促進苗木生長的作用。褐環乳牛肝菌與松科合成菌根的研究較多,紅汁乳菇研究報道較少,周崇蓮等[19]報道了紅汁乳菇與馬尾松形成菌根促進生長；薛振文等[20]研究了與馬尾松接種適宜的紅汁乳菇菌劑量；李小利[21]研究了紅汁乳菇與黑松能形成菌根,其他大多是野外調查紅汁乳菇與松科植物的菌根情況[22]。本研究證明紅汁乳菇也能在人工條件下與油松形成菌根,并促進油松生長。但研究結果表明接種褐環乳牛肝菌對油松幼苗生長及生物量的積累作用優于紅汁乳菇,同時,接種褐環乳牛肝菌的油松苗木針葉和根系中保護酶活性均高于紅汁乳菇接種苗木。生長健壯的苗木,其體內抗氧化酶系也相應的高,進一步從生理角度證明適宜接種褐環乳牛肝菌培育油松壯苗。

根系長度、表面積和體積是衡量植物根系分布范圍的重要參數,接種紅汁乳菇和褐環乳牛肝菌增加了油松根系總長度、表面積和體積。平均根系直徑、根尖數、分叉數是衡量根系吸收功效的重要參數,接種紅汁乳菇和褐環乳牛肝菌增加了油松根系平均直徑、根尖數、分叉數。這與翟帥帥等[10]在褐環乳牛肝菌對馬尾松根系構型的促進作用的研究結果一致。

不同處理油松幼苗的根系各不同角度的根分布不均衡,其中接種褐環乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側根占23.81%,顯著大于紅汁乳菇接種處理,<60°的一級側根顯著低于紅汁乳菇處理。結合根系生長參數、一級側根角度綜合看,雖然在根系總長度、表面積等參數上紅汁乳菇和褐環乳牛肝菌作用基本相同,但接種褐環乳牛肝菌油松幼苗一級側根角度中80°—90°的一級側根最多,有利于根系擴大沿根圍向不同方向生長的范圍,表明褐環乳牛肝菌形成的油松根系發達、分布范圍廣,更利于養分和水分的吸收。所以接種褐環乳牛肝菌的處理方式更有利于油松生長。對照根系中80°—90°的一級側根很少,限制了根系的橫向生長。一旦外生菌根菌與樹木根形成外生菌根后,特殊結構和根-菌互作,使外生菌根具有諸多功能。有些地區缺乏外生菌根菌,在常規造林的過程中使其自然感染菌根真菌是相當難的,為了達到更高的油松造林成活率,人為菌根化苗木的培育就顯得十分重要。

由于研究條件等的限制,相比較地上部分功能形狀的研究,根系研究仍相對滯后[23]。本研究中選用傳統方法中的容器法,由于受容器限制,會抑制或影響根系生長,從而致使觀測數據與實際情況的不符,還需要今后利用苗圃等野外實驗條件進一步實驗。