銀北鹽漬化土壤中6種耐鹽植物根際細菌群落結構及其多樣性

代金霞,田平雅,張 瑩,蘇建宇

寧夏大學生命科學學院, 銀川 750021

土壤鹽堿化問題是目前全球最嚴重的環境問題之一。開發和利用大面積的鹽堿土壤,不僅是增加農業可利用土地資源的需要,也是改善生態環境、增加綠色植被、提高森林覆蓋率的需要[1]。寧夏銀北鹽堿區屬我國5大鹽堿土區的西北半干旱鹽堿土區,蒸發量遠遠高于降水量,水資源缺乏。土壤鹽堿化已成為影響寧夏農業生產和經濟發展的限制性因素之一[2]。近年來,以耐鹽植物種植為核心的鹽堿地改良利用技術逐漸被重視起來。但鹽堿地特殊的土壤性質會導致植物出現成活率低、保存率低等現象,成為限制這一技術發展的瓶頸[3]。

根際微生物作為土壤-根系間養分轉化和轉運的調節器,是受植物影響最大的土壤微生物群體[4]。已有的資料表明,根際微生物在其生命活動過程中通過產生大量的有機酸、不斷釋放土壤養分、有效改善鹽堿土壤的理化性質和土壤結構等提高土壤肥力,對通過植被恢復改良鹽堿地起到一定的作用[5- 7]。但目前鹽堿地生物改良措施的研究大多是耐鹽植物品種的選育和改良,針對鹽堿土壤中微生物群落結構、優勢種群、微生物-植物-鹽堿土壤之間的交互作用等研究尚不系統[8]。因此,開展鹽堿土壤中不同植物根際微生物群落組成和多樣性研究,不僅有助于認識微生物群落功能調節并發掘新的功能類群,而且對加強鹽生植物資源的開發和利用以及改良鹽堿土壤都具有十分重要的意義。

本研究通過高通量測序和分離培養方法,對寧夏銀北地區鹽漬化土壤中的6種耐鹽植物根際細菌的群落結構和遺傳多樣性進行了分析,以期為加速植被恢復改良鹽堿地提供依據,也為開展鹽堿區土壤微生物資源的開發和利用研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究區概況

寧夏銀北地區屬我國5大鹽堿土區的西北半干旱鹽堿土區,該地區年均蒸發量2444 mm,年均降雨量只有292 mm,為中溫干旱氣候,常年干旱少雨且蒸發量大,富水性差,主要土壤為鹽堿土,植被類型以耐鹽堿植物為主[9]。

1.1.2土壤樣品采集

于2017年5—7月份在銀北西大灘鹽堿地(38°50′ 23.8″ N,106°23′ 54.1″ E)采集6種耐鹽堿植物根際土壤。其中枸杞Lyciumbarbarum、苜蓿Medicagosativa、柳枝稷Panicumvirgatum為該區鹽堿地改良中人工種植4年的植被,苦豆子Sophoraalopecuroides、檉柳Tamarixchinensis和芨芨草Achnatherumsplendens為該區主要分布的野生植被。采用五點取樣法,每個樣點各選取3棵植株,用鐵鏟去除植株根部周圍枯落物和土壤,在距地表20—30 cm深處,待根部露出后收集根上附著的土壤置于滅菌的50 mL離心管中,將不同樣點的土壤混勻,根據植被種類將土壤樣品編號后,置于冰盒立即帶回實驗室,部分新鮮土樣用于DNA提取和菌株分離,剩余部分風干過篩后根據《土壤農業化學分析方法》測定土壤理化性質[10]。

1.2 方法

1.2.1土壤基因組提取和16S rRNA基因V3—V4區片段擴增

按照美國Omega biotek公司土壤基因組提取試劑盒(D5625 Soil DNA Kit)操作說明提取不同植物各3個重復根際土壤基因組。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,測定DNA純度和濃度。用滅菌去離子水將適量的DNA樣品稀釋至1 ng/μL,以其為模板,擴增16S rRNA基因的V3—V4區,使用帶 Barcode 的特異引物對515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。擴增結束后將同種植物根際土壤的3個PCR產物進行等量混樣,充分混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,使用QIAamp DNA Micro Kit(QIAGEN公司)回收目的條帶產物。

1.2.2文庫構建、高通量測序和數據分析

PCR回收產物委托北京諾禾致源公司進行文庫構建和高通量測序,采用Illumina HiSeq測序平臺。通過對測序結果進行拼接和質控,得到有效序列,基于有效序列利用Uparse pipeline (v7.0.1001)對所有樣品的全部有效標簽序列聚類,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),獲得OTUs聚類代表序列,利用RDP classifier(V2.2)[11]軟件進行物種注釋、豐度和多樣性指數分析,同時在各個分類水平上對物種注釋結果進行群落結構的統計分析。采用Spearman相關性分析(SPSS 19.0軟件)對根際細菌群落組成和環境因子的相關性進行分析。

1.2.3根際可培養細菌的生物學活性和鹽堿耐受性測定

用無菌稱量紙分別稱取上述6種根際土壤樣品10 g于200 mL的LB培養液中,28℃條件下150 r/min培養30 min,取1 mL土壤懸液梯度稀釋至10-3后吸取200 μL涂布于LB平板上,28℃恒溫箱中培養48 h,挑取單菌落劃線5次純化,鏡檢后將純化菌株接種于LB培養液中28℃培養48 h,取50 μL菌液點接于含有(Ca3(PO4)2)的PKO檢測平板上,28℃培養7—10 d,根據菌落周圍產生的透明溶磷圈的大小檢測菌株的解磷能力[12]。將菌株分別接種到阿須貝無氮培養基和以ACC為唯一氮源的ADF培養基上,連續轉接5次都能正常生長的菌株視為具備固氮活性和產ACC脫氨酶活性[13- 14]。

在LB培養基中加入NaCl使其質量分數為6%—15%,以含1% NaCl的LB平板作為對照,將菌懸液點接于平板用于檢測菌株的耐鹽性；用l mol/L的NaOH將高壓滅菌的LB培養基調節pH值為9.0、10.0、11.0、12.0共4個梯度后倒平板,以pH 7.0的LB平板作為對照檢測菌株的耐堿性。每株菌設置3個重復,置恒溫培養箱中28℃培養2—3 d,觀察平板上菌的生長情況。

1.2.4根際可培養細菌的多樣性及其系統發育分析

觀察菌落和菌體形態,結合菌株的生物學特性,選取代表菌株提取其基因組DNA,采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)/1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT- 3′)進行16S rRNA基因的擴增和序列測定。序列在GenBank中進行BLAST同源性比較(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/),用Clustal X進行多重比對,運用MEGA7.0[15]軟件,采用Neighbor-Joining 法構建系統樹,對菌株進行分子鑒定和系統發育分析。

2 結果和分析

2.1 不同植物根際土壤理化性質

研究區6種耐鹽植物根際土壤理化性質見表1。土壤pH在8.16—9.25之間,呈堿性,有機質含量較低,總氮磷鉀的含量在不同植物根際變化幅度不大。

2.2 根際土壤樣品的OTU聚類和Alpha 多樣性分析

由 MiSeq測序所得樣品數據經質控后,各分類水平上分別獲得較多的有效序列(圖1),在不同土壤樣品中有效序列數目為枸杞>苦豆子>苜蓿>芨芨草>柳枝稷>檉柳,即枸杞根際土壤獲得的有效序列最多,檉柳根際最少。序列長度均大于400 bp,滿足分析要求。對完成質控并去除嵌合體之后的有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs,統計得到各個樣品在不同 OTU 中的豐度信息。結果表明,6種土壤樣品分別產生1571—2100個 OTU(表2),文庫覆蓋度在0.985—0.991之間,說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種,樣本所建立的細菌文庫能夠比較有效地反映其多樣性。不同根際土壤中物種豐富度指數(Chao 1指數和ACE指數)和多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)存在明顯差異,根際細菌物種多樣性在各樣品間表現為芨芨草>檉柳>苜蓿>柳枝稷>枸杞>苦豆子,芨芨草和檉柳根際細菌多樣性較高,苦豆子最低；而豐富度則體現為苜蓿>芨芨草>苦豆子>柳枝稷>檉柳>枸杞,說明苜蓿和芨芨草根際土壤的細菌豐富度要高于其他植物根際土壤。

表1 不同耐鹽植物根際土壤理化性質

ACE：基于豐度覆蓋的估算,Abundance Coverage-based Estimator

2.3 6種植物根際細菌的群落結構組成分析

測序結果通過物種注釋,6種根際土壤共獲得31門67綱253科400屬土壤細菌,選取每個樣品在門水平豐度前十的物種,以Weighted Unifrac距離矩陣構建樣品的UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means,非加權組平均法)聚類樹,并將聚類結果與各樣品的物種相對豐度整合來研究不同樣品間的相似性(圖2)。由圖2可以看出,厚壁菌門(Firmicutes,26.50%—62.33%)、變形菌門(Proteobacteria,16.54%—29.06%)和放線菌門(Actinobacteria,7.74%—21.15%)是根際土壤的優勢菌群,相對豐度最高,其次是擬桿菌門(Bacteroidetes,4.84%—12.26%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,2.68%—6.69%)和酸桿菌(Acidobacteria,1.46%—3.97%),而疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、熱微菌門(Thermomicrobia)和 單糖菌門(Saccharibacteria) 都以較低豐度分布在土壤中。在不同土壤樣品中厚壁菌門相對豐度依次為苦豆子>枸杞>柳枝稷>苜蓿>芨芨草>檉柳,在苦豆子根際土壤中高達62.33%,為絕對優勢類群。變形菌門相對豐度依次為檉柳>芨芨草>柳枝稷>枸杞>苜蓿>苦豆子,在檉柳根際變形菌門豐度(29.06%)略高于厚壁菌門(26.50%),其余5種植物根際均以厚壁菌門占優勢。放線菌門豐度在各土壤中表現為芨芨草>檉柳>苜蓿>枸杞>柳枝稷>苦豆子。通過聚類圖可以看出,在門水平上6種根際土壤細菌的群落結構組成表現為芨芨草和檉柳相似,柳枝稷、苜蓿和枸杞相似,苦豆子則與另外5種差別最大。

圖2 基于非加權組平均法的門水平聚類圖Fig.2 The clustering map at phylum level based on unweighted pair-group method

選取每個樣品在綱和屬水平上最大豐度前十的物種,生成物種相對豐度柱形圖(圖3、圖4)。6種根際土壤中都以芽孢桿菌綱(Bacilli)占優勢,相對豐度為17.67%—57.71%,在各土壤中依次表現為苦豆子>枸杞>柳枝稷>苜蓿>檉柳>芨芨草,是苦豆子根際的絕對優勢菌綱。其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,6.39%—15.37%),在枸杞根際豐度最高,苦豆子根際最低,其豐度依次為枸杞>檉柳>芨芨草>柳枝稷>苜蓿>苦豆子;γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,4.17%—9.69%)、梭菌綱(Clostridia,0.89%—8.72%)、酸微菌綱(Acidimicrobiia,3.54%—7.86%)和放線菌綱(Actinobacteria,1.95%—7.82%)等在不同樣品中豐度略有差異。在屬水平上以芽孢桿菌屬(Bacillus)為絕對優勢屬(15.57%—53.85%),在6種根際土壤中其豐度依次為苦豆子>枸杞>柳枝稷>苜蓿>檉柳>芨芨草；其余各屬豐度均遠低于芽孢桿菌,在不同土壤中占比不同,如鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas,1.32%—3.72%)在柳枝稷根際豐度略高,不動桿菌屬(Acinetobacter,0.14%—3.21%)在芨芨草、苦豆子和苜蓿根際豐度相當,節桿菌屬(Arthrobacter,0.24%—2.51%)、乳酸乳球菌屬(Lactococcus,0.71%—2.43%)、腈基降解菌屬(Nitriliruptor,0.21%—2.35%)等都以較低豐度分布于不同土壤樣品中,說明植物種類會影響其根際微生物的群落組成和多樣性。

圖3 綱水平上的物種相對豐度圖Fig.3 Relative abundance of species at class level

圖4 屬水平上的物種相對豐度圖Fig.4 Rrelative abundance of species at genus level

2.4 根際細菌群落組成與環境因子的相關性分析

用Spearman秩相關來研究環境因子與根際優勢菌群豐度之間的相互變化關系,得到兩兩之間的相關性熱圖(圖5)。從圖中可以看出,在相對豐度前十的優勢類群中,厚壁菌門與土壤pH、總氮(TN)和總磷(TP)呈現正相關,和電導率、速效氮呈負相關；變形菌門、放線菌門和擬桿菌門則與土壤pH、有機質、總氮磷鉀都呈現負相關,與電導率、速效氮呈正相關,但相關性都不顯著；僅酸桿菌門與土壤有機質(SOM)顯著正相關,熱微菌門與速效氮極顯著正相關,與總鉀含量顯著負相關； 單糖菌門(Saccharibacteria)與速效磷顯著負相關；在相對豐度<0.1的菌群中,綠菌門(Chlorobi)與土壤有機質和總氮含量極顯著正相關,硝化螺旋菌門(Nitrospirae)與總鉀含量極顯著正相關,與速效氮顯著負相關；裝甲菌門(Armatimonadetes)與總氮和總鉀含量顯著正相關,與電導率(EC)顯著負相關。多數菌群組成與土壤理化因子之間相關性不顯著。

圖5 細菌群落組成與土壤理化因子的spearman 相關性分析Fig.5 Spearman correlation analysis among soil physico-chemistry characteristics and rhizobacteria communityEC：電導率,electric conductivity；pH：酸堿度,potential hydrogen；SOM：土壤有機質,soil organic matter；TN：總氮,total nitrogen；TP：總磷,total phosphorus；TK：總鉀,total potassium；AN：速效氮,availliable nitrogen； AP：速效磷,availliable phosphorus；AK：速效鉀,availliable potassium

2.5 可培養根際細菌的生物學特性和系統發育分析

從6種根際土壤中共分離出細菌110株,其中自苜蓿和檉柳根際分離菌株數較多,分別為30株和26株,分離自芨芨草根際的細菌數量最少,僅有10株(表3)。許多菌株具有一種以上生物學活性,其中23株菌在含有(Ca3(PO4)2)的平板上能夠形成明顯的解磷圈,具有溶解無機磷的能力；在阿須貝和ADF培養基上轉接5次仍能正常生長的菌株分別有37和46株。多數菌株具備較強的耐鹽堿性,所有菌株都能在含6% NaCl的培養基中生長,70株菌可以耐受10% 的NaCl,其中20株在含15% NaCl的培養基中仍能生長。所有菌株在pH 9.0的條件下都能正常生長,74個菌株在pH 12.0的條件下仍然長勢良好,其中分離自檉柳、芨芨草和柳枝稷根際土壤的菌株鹽堿耐受性普遍較強。

表3 6種耐鹽植物根際土壤中活性菌株數量

ACC：1-氨基環丙烷- 1-羧酸,1-aminocyclopropane- 1-carboxylate

圖6 基于 16S rRNA 基因序列構建的部分根際細菌的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of partial rhizobacteria isolates based on the 16S rRNA gene sequences

通過菌落和菌體形態的初步歸類,結合菌株的生物學活性,選取其中50個具有較強鹽堿耐受性(耐受10% 的NaCl或pH 12.0),或具備解磷、固氮或產ACC脫氨酶能力的代表菌株進行16S rRNA基因序列分析。結果表明,這些菌株隸屬于5個屬,在屬水平上多樣性單一,芽孢桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)是6種根際土壤的共有屬,其中31個菌株與芽孢桿菌屬細菌有99%—100%的序列同源性。選取部分菌株序列構建的系統樹如圖6,其中代表菌株LZJ12、JJC11與B.subtilissubsp.inaquosorum的序列同源性為99%,CL11、LZJ13與B.atrophaeus、LZJ4與B.sonorensis分別有100% 的序列同源性,這5株菌都可以耐受15% 的NaCl,也可在pH 12. 0的條件下生長,同時具備2種以上活性。KDZ12和KDZ4則與B.cereus和B.thuringiensis有99%的相似性,表明芽孢桿菌在種水平上的多樣性較為豐富。有12株菌隸屬于假單胞菌屬,其中分離自枸杞和苦豆子根際的各4株,苜蓿根際2株,檉柳和柳枝稷根際各1株,分別與P.fluorescens、P.brassicacearum和P.corrugata有99%—100%的序列同源性；4株隸屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium),分別與S.faecium和S.kitahiroshimense有98%的序列同源性,這些菌株可耐受pH 12. 0的條件,但NaCl耐受性相對較弱,不能在高于8% NaCl 的鹽濃度中生長；分離自苜蓿根際的菌株MX7與其他菌株在形態上完全不同,經16S rRNA序列鑒定隸屬于節桿菌屬Arthrobacter,與該屬菌株A.humicola有100%的序列同源性；MX11和MX15同時具備固氮和解磷能力,與中華根瘤菌Sinorhizobiummeliloti有99%的序列同源性。與其他5種根際土壤相比,苜蓿根際可培養細菌的多樣性較豐富,包括了鑒定出的所有菌屬。將所測菌株的16S rDNA序列提交至Genbank,獲得序列登陸號為MG735362-MG735411。

3 討論

根際微生物是土壤-根系間養分轉化和轉運的調節器,也是受植物影響最大的土壤微生物群體[4]。作為土壤生態系統中最為活躍的構成因子,根際細菌參與了土壤中各種生物學和生物化學過程,對植物的生長發育和環境適應性產生重要的影響[16- 18]。

銀北鹽漬化土壤中6種耐鹽植物根際細菌的群落結構分析表明,不同植物根際細菌群落在各水平上組成相似,物種多樣性和相對豐度都因植物種類而不同?？傮w上看,根際細菌的多樣性呈現為芨芨草>檉柳>苜蓿>柳枝稷>枸杞>苦豆子,而豐富度則呈現為苜蓿>芨芨草>苦豆子>柳枝稷>檉柳>枸杞。微生物的群落結構存在生境異質性,生態環境的不同造成微生物群落結構的組成和優勢類群的相對豐度不同,而生態環境相似的地區土壤微生物結構較為相似[19]。本研究中6種耐鹽植物根際細菌群落結構整體表現為野生的芨芨草和檉柳相似,而人工種植的柳枝稷、苜蓿和枸杞更為相似,苦豆子則明顯區別于其他根際。這一結果的產生主要是由于3種人工種植的植物一直有著相同的田間管理措施,在一定空間尺度下具有相似的環境條件,明顯不同于自然生長在鹽堿荒地中的芨芨草和檉柳,而苦豆子主要分布在研究區土壤含水量較高的溝旁和田邊地頭低濕處,土壤因子可能對其根際細菌群落結構產生了較大的影響。

植被類型和土壤性質是影響植物根際細菌結構組成和多樣性的重要因素之一[20]。杜瀅鑫等[8]對大慶鹽堿地九種植物根際土壤微生物群落結構的研究表明,酸桿菌門 、變形菌門是根際土壤優勢菌群；李靖宇等[21]研究了沙坡頭地區不同植物群落的土壤微生物多樣性、劉洋等[22]比較了黃土高原4種喬木林土壤細菌的群落組成,結果都顯示變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等豐度較高,為土壤優勢類群；而在銀北鹽漬化土壤中,厚壁菌門為絕對優勢菌群,其相對豐度遠高于其他研究,且酸桿菌門的豐度也遠遠低于變形菌門和放線菌門。微生物群落組成與環境因子的相關性分析表明,特定的菌群與特定的土壤因子相關,如絕對優勢類群厚壁菌門與土壤pH值、總氮和總磷正相關,次優勢類群變形菌門、放線菌門和擬桿菌門則與電導率、速效氮呈正相關,與土壤pH和有機質等呈現負相關,這與Nacke等的研究一致[23],表明銀北鹽漬化土壤中優勢菌群在很大程度上受土壤pH值的影響。植物與土壤微生物之間通過凋落物和根系分泌物建立起密切的聯系。因此植物種類不同,其凋落物的數量和根系分泌物的種類會對植物根際土壤理化性質產生影響,而特定的土壤性質又會引起功能微生物類群在根際的富集。很多厚壁菌可以產生芽孢,能夠抵抗脫水,適應干旱和極端環境的能力極強；變形菌在植物根際能夠快速地增長；放線菌是降解木質素與纖維素的主要功能菌群。這些富集于植物根際的功能微生物可以直接表征土壤營養轉化及微生物的環境適應性[24]。銀北地區土壤鹽堿化程度較高,常年干旱少雨,營養物質匱乏,其土壤微生物群落可能是在長期的逆境脅迫下,經過自然選擇而適應生態環境的表現。

土壤中的絕大多數微生物由于受生長條件和培養基選擇性的限制是無法培養的,因此僅用傳統的分離方法不能真實和準確的反應出土壤中微生物的結構組成和多樣性[25]。高通量測序技術的成熟,使我們能夠通過對環境微生物直接進行深度測序,從而較為全面和準確地在微生物群落水平分析物種的遺傳多樣性和相對豐度,并能較為客觀地反映其中低豐度的重要功能微生物[26]。在6種耐鹽植物根際細菌的高通量測序結果中,很多相對豐度較高的類群如鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬、乳酸乳球菌屬等細菌,可能由于培養條件的限制并未通過培養方法獲得。而一些相對豐度較低的菌屬,如假單胞菌、鞘氨醇桿菌、節桿菌和中華根瘤菌能夠分離培養獲得,而且其中多數菌株具備較強的鹽堿耐受性,同時還具有解磷、固氮或產ACC脫氨酶等一種或多種生物活性。解磷菌通過溶解土壤中難溶性的磷來促進植物對磷的吸收利用,固氮菌能夠將空氣中的氮素固定為化合態氮供植物利用,產ACC脫氨酶細菌通過抑制植物體內乙烯的積累而減輕逆境下乙烯對植物的傷害,同時提高植物抗鹽堿和干旱等逆境脅迫。菌株分離結果顯示芽孢桿菌屬是分離頻率最高的類群,許多芽孢桿菌不僅具有多種生物學功能,還可以有效抵御外界的有害因子,具有極強的抗逆性強；鞘氨醇桿菌有著極強的生命力和耐貧營養能力；假單胞菌屬、節桿菌等也是土壤中常見的根際促生菌,許多菌株被報道可以分泌多種抗生素或生長激素,能有效抑制病原菌、顯著提高植物的抗病性和促進植物的生長,是優良的根際促生菌類群[27- 28]。在營養物質匱乏的銀北鹽堿地中,這些定殖在根際土壤中的功能細菌可能通過代謝作用適應其所處的環境而得以存活并發揮著一定的作用。因此建議在今后開展鹽堿地微生物群落多樣性研究中,有必要將傳統的分離方法和新一代測序技術結合起來,這樣既能真實和準確地反映出土壤中微生物的結構組成和多樣性,也能分離獲得促生耐鹽堿的生態功能菌株,為豐富鹽堿區微生物資源、有效利用植物根際促生菌改良鹽堿土奠定基礎。