不同利用方式對內(nèi)蒙古羊草草原氨氧化微生物豐度的影響

朱 蕊，陳 清，馬成倉，王中良

(1. 天津師范大學(xué)天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387)

羊草(Leymuschinensis)草原是北方典型草原區(qū)和草甸草原區(qū)的重要草地資源類型之一，具有重要的生態(tài)功能和經(jīng)濟價值[1]。目前，由于人類對草地的不合理利用，改變草原生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)(如氮素循環(huán)[2])，造成營養(yǎng)物質(zhì)流失和草原的大面積退化[3-4]。圍封作為退化草地恢復(fù)的一種重要手段在草原區(qū)得到廣泛應(yīng)用[5-6]。草地管理方式改變?nèi)绾斡绊懙氐纳锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)，進而影響草原生態(tài)系統(tǒng)功能是一個廣泛關(guān)注的問題。硝化作用在地球氮素循環(huán)中具有重要作用，是固氮和反硝化作用的中心環(huán)節(jié)，它決定了氮素對植物的有效性[7]。氨氧化過程是將氨氧化為亞硝酸的過程，是硝化作用的第一步也是限速步驟，由氨氧化微生物氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea，AOA)和氨氧化細菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)完成[8]。草地利用方式的改變會影響AOA和AOB豐度，進而影響硝化作用和土壤氮素周轉(zhuǎn)，國內(nèi)外學(xué)者針對放牧和圍封對氨氧化微生物的影響開展了研究，結(jié)果表明不同的草地利用方式會對氨氧化微生物產(chǎn)生不同的影響[9-10]。在內(nèi)蒙古荒漠草原長期圍封處理后AOB豐度顯著增多，而AOA豐度對于土地利用變化的響應(yīng)不明顯[9]。德國西南部士瓦本山(Schwabische Alb)草原的研究發(fā)現(xiàn)，AOB非常穩(wěn)定不受土地利用強度的影響，而AOA受土地利用強度的影響顯著[10]。土地利用方式改變后，草原土壤硝化潛勢和氨氧化微生物如何變化，不同研究區(qū)域由于環(huán)境因子差異，研究結(jié)果不盡相同。目前，內(nèi)蒙古羊草草原大部分研究集中在放牧對氨氧化微生物的影響方面[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)AOA隨著放牧強度的增加而顯著增加，而AOB的豐度在不同措施下都無顯著變化[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)AOB豐度隨著放牧強度的增加顯著下降，放牧對AOA豐度無顯著影響[12]。目前，長期圍封對內(nèi)蒙古羊草草原氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的影響的研究鮮見報道。因此，本試驗以內(nèi)蒙古羊草草原為研究區(qū)域，通過分子生物學(xué)研究方法，研究不同利用方式下氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的變化趨勢，探究圍封后土壤中硝化過程轉(zhuǎn)變的微生物機制，研究結(jié)果對于理解草地圍封管理對于氮素周轉(zhuǎn)影響的機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

土樣采集于2015年8月8日，采樣地點位于內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站羊草樣地北側(cè)，錫林河流域中部(43°26′～44°29′N，115°32′～117°12′E)。該地區(qū)是溫帶典型草原，屬于半干旱草原氣候；年平均氣溫為0.7℃，冬季寒冷干燥，夏季溫暖濕潤；年平均降水量343 mm，降水集中于5-9月份，占全年降水量的80%左右，且降水的年際變化顯著。土壤為暗栗鈣土，土壤含水量為7.31%，pH為7.35～7.96，全氮含量為1.34 g·kg-1，銨態(tài)氮含量為2.18 mg·kg-1。植被以相對生物量為18%的羊草(Leymuschinensis)、34%的大針茅(Stipagrandis)、17%的糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)、13%的冰草(Agropyroncristatum)等為主[13]。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗設(shè)放牧和圍封2個處理。從2005年開始選擇地勢平坦、植被均勻有代表性的樣地進行圍封，圍封面積為0.2 ha，該圍封樣地是課題組長期水分、氮素添加的野外試驗基地[14]，該樣地在2005年之前進行了30年的連續(xù)放牧，放牧的強度約為2只羊·ha-1，并且此樣地未曾施用過任何肥料。本試驗的圍封處理是長期定位野外試驗樣地的對照處理，即不加水不加氮的單圍封處理。圍欄內(nèi)單圍封不加水和氮處理設(shè)有4個小區(qū)(即4個重復(fù))，每個小區(qū)面積5 m×8 m。該樣地在圍欄外仍然繼續(xù)全年完全自由放牧，為本研究的自然放牧處理。2015年8月中旬進行土樣采集，圍欄內(nèi)在單圍封的4個小區(qū)采集土壤樣品，與圍欄內(nèi)對應(yīng)，圍欄外自由放牧處理隨機選擇4個樣點，即4個重復(fù)。圍欄內(nèi)每個小區(qū)和圍欄外每個采樣點使用直徑為2 cm的土鉆隨機取0～15cm的土壤5鉆，5鉆混為一份樣品，過2 mm篩，混合均勻，采用“四分法”選取部分土壤，裝入封口袋中密封，圍欄內(nèi)外一共取40鉆土，混合為8個土樣(圍欄內(nèi)外各4個)。土壤進行分裝，用生物冰袋冷藏，一部分鮮土帶回實驗室-80℃冷凍用于土壤總DNA的提取，一部分鮮土4℃保存用于硝化潛勢的測定。

1.3 指標測定

1.3.2土壤總DNA提取和PCR擴增 土壤總DNA提取采用FASTDNA?SPIN Kit for soil(Q BIOgene Inc.，Carlsbad，CA)，取500 mg土壤樣品，操作過程完全按照試劑盒說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA片段大小。氨氧化微生物選用amoA功能基因特異引物(表1)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中，正反引物各0.5μL，10×buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O 15 μL。

1.3.3克隆文庫構(gòu)建 PCR擴增產(chǎn)物進行切膠純化，將純化后產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，再通過熱激法將載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞(JM109)(TaKaRa,Dalian)，取轉(zhuǎn)化液涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)16～18 h。進行藍白斑篩選，選取大約100個白色克隆用的通用引物M13F和M13R進行菌落PCR擴增，將陽性克隆菌液送上海美吉公司進行測序分析。重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)GenBank的Blast比對,分別與已發(fā)表的AOA和AOB氨單加氧酶amoA基因序列進行多重序列比對。表明重組質(zhì)?？梢宰鳛榘毖趸⑸镞M行絕對熒光定量PCR分析的標準DNA。

1.3.4氨氧化微生物豐度的測定 采用實時熒光定量PCR測定土壤氨氧化古菌和細菌(AOA和AOB)的豐度，對氨氧化微生物的氨單加氧酶活性多肽位點基因(amoA基因)進行定量分析。其定量PCR均采用SYBRGreen法。AOA和AOB定量均采用定性分析所用引物(表1)。擴增體系為20 μL，包含：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,正反向引物各0.5 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 7 μL。采用ABI 7500實時定量擴增PCR儀，對氨氧化微生物進行定量分析。試驗設(shè)置陰性對照，并將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA梯度進行稀釋，得到標準曲線，每個樣品3次重復(fù)，標線和樣品的溶解曲線為單一峰。

注：F為上游引物，R為下游引物

Note：F is upstream primer and R is downstream primer

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用Origin 8.6進行數(shù)據(jù)分析與作圖，SPSS 17.0軟件對各指標進行獨立樣本T檢驗和相關(guān)性分析檢驗不同處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同利用方式對氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的影響

自然放牧狀態(tài)下，AOA-amoA基因拷貝數(shù)為每克干土3.4×108個，AOB-amoA基因拷貝數(shù)為每克干土1.17×106個，AOA豐度顯著高于AOB的豐度(圖1)。與自然放牧相比，圍封后AOA豐度顯著下降(P<0.01)，下降了46.5%，而AOB豐度沒有顯著變化(P>0.05)，圍封后AOA豐度仍高于AOB豐度。與自然放牧相比，長期圍封顯著降低土壤的硝化潛勢(P<0.05，圖2)。

圖1 不同利用方式對AOA和AOB豐度的影響Fig.1 Effects of land use pattern changes on abundance of AOA and AOB注：圖中誤差線表示標準誤差，不同小寫字母代表放牧與圍封處理間差異顯著(P<0.05)。下同Note:The error bar in the figure represents standard errors,and different lower-case letters represent significant differences between graze and exclosure treatments (P<0.05). The same as below

圖2 不同利用方式對硝化潛勢的影響Fig.2 Effects of land use pattern changes on potential nitrification rate

2.2 硝化潛勢與AOA和AOB豐度的關(guān)系

3 討論

本研究結(jié)果顯示內(nèi)蒙古羊草草原長期圍封后，土壤硝化潛勢和AOA豐度顯著下降，AOB豐度則無顯著變化(圖1，圖2)；硝化潛勢與AOA豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與AOB豐度沒有顯著性相關(guān)(圖3)，內(nèi)蒙古羊草草原AOA相較于AOB對草地利用方式改變的響應(yīng)更敏感，硝化作用可能由AOA主導(dǎo)。相似的研究結(jié)果也在內(nèi)蒙古典型草原發(fā)現(xiàn)，AOA隨著草地利用方式(放牧和割草)的改變而發(fā)生顯著變化，而AOB豐度在不同草地利用方式下都無顯著變化[17]。在法國Theix地區(qū)的半天然放牧草地的研究中也發(fā)現(xiàn)AOA對草地利用的改變更敏感，圍封休牧降低了AOA的豐度，反之，適當?shù)姆拍翉姸葧黾覣OA豐度，但是圍封和放牧均沒有對AOB產(chǎn)生顯著影響[18]。

土壤理化性質(zhì)是決定氨氧化微生物豐度對土地利用方式響應(yīng)的重要因素[19]。在本研究中，AOA可能是決定硝化潛勢的優(yōu)勢種群，可能的原因是：1)土壤pH。前人通過分子生態(tài)學(xué)穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)(DNA-SIP)，驗證了AOA在酸性土壤(pH=4.9～7.5)中更易生存[20-22]，AOB更喜在堿性土壤(pH=8.3～8.7)中生存[23-25]。本研究中，土壤偏中性(pH=7.35)，AOA與硝化潛勢呈顯著正相關(guān)，AOA對草原利用方式改變的響應(yīng)比AOB更敏感。相反，在土壤呈堿性(pH=8.12～8.27)的內(nèi)蒙古四子王旗荒漠草原和武川縣高原草原的研究表明，AOB豐度相較于AOA在長期圍封處理后更敏感，而對AOA影響不顯著[9,26]。2)土壤氮素。研究發(fā)現(xiàn)AOA更好的適應(yīng)低氮低肥力的環(huán)境中，AOB更傾向于在高氮高肥力的環(huán)境中生存[27-28]。對我國北方4類土壤中氨氧化微生物的活性及對氨氧化的貢獻研究發(fā)現(xiàn)，AOA普遍在氨氮含量較低的草原土壤中主導(dǎo)硝化作用，而AOB在氨氮含量較高的濕地土壤中主導(dǎo)硝化作用[28]。本試驗中，土壤全氮和氨氮含量較低(全氮含量為1.34 g·kg-1，氨氮含量為2.18 mg·kg-1)，可能成為AOA主導(dǎo)硝化作用的重要原因。3)土壤水分。研究發(fā)現(xiàn)在旱地生態(tài)系統(tǒng)中，水的可利用性在氨氧化過程中起著重要作用，AOA比AOB更容易在干旱環(huán)境中生長[17,26]。因此，在中性土壤、低肥力和低水分的土壤環(huán)境中，內(nèi)蒙古羊草草原AOA比AOB對土地利用類型變化更加敏感。土壤環(huán)境背景一定程度上決定了對硝化過程起主導(dǎo)作用的氨氧化微生物類型[26,28]，因此，草地不同利用方式與其他土壤環(huán)境因素的交互作用對內(nèi)蒙古羊草草原的氨氧化微生物的影響還有待更加深入的研究。

4 結(jié)論

內(nèi)蒙古羊草草原長期圍封后，AOA豐度顯著下降，AOB豐度則無顯著變化;土壤硝化潛勢與AOA豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與AOB豐度沒有顯著性相關(guān)。AOA豐度對于草地圍封的改變更敏感，可能是影響土壤硝化潛勢的優(yōu)勢種群。