響應面優化法微波輔助提取地錦草多糖的工藝研究

吳建麗，王魯豫，張 強，孫云夢

(黃河科技學院 醫學院，河南 鄭州 450000)

地錦草是藥用價值很高的植物，研究報道地錦草化學成分多達十幾種，主要有多糖、黃酮、甾體苷等[1]。故其藥理作用也非常多，如：止血、保肝、抗氧化等[2-3]。多糖是一種廣泛存在于自然界生物體的天然功能性高分子化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、等多種生理活性，因此研究天然產物中多糖的提取工藝對資源的開發與利用意義重大。響應面方法[4-6]是利用合理的實驗設計并通過試驗得到一定的數據，采用多元二次方程的分析來尋求最優化工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。本文在前期工作[7]的基礎上，就提取中影響多糖得率的幾個重要因素做了系統研究，并用響應面分析法對地錦草多糖的提取條件進行了優化。用Box-Behnken的中心組合試驗設計，對試驗數據進行分析，對擬合數學模型進行了較為相繼的描述，得到了地錦草多糖提取的最佳工藝參數，以期為地錦草多糖的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地錦草：采自黃河科技學院周邊野地，洗凈，曬干，粉碎，過100目篩，備用；葡萄糖標準品、苯酚、濃硫酸、甲醇、乙醇：分析純；石油醚(沸點60～90℃)；5%苯酚，自制；純化水。

1.2 儀器與設備

FA1004型電子天平：上海良平儀表有限公司；HK-10B500g型搖擺式粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；TL80-1型醫用離心機：中國姜堰市天力醫療器械有限公司；JH7230G型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；WBFY-201型微波反應器:上海丞明儀器設備有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 地錦草多糖提取的工藝流程

(1)地錦草石油醚脫脂，甲醇脫色；(3)按照一定的浸泡時間，微波功率，微波時間，液料比進行提取；(4)提取液離心，收集上清液，回流濃縮，冷卻；(5)濃縮液4 ℃靜置12 h醇沉，3000 r/min離心20 min，棄上清液；(6)轉移至100 mL 容量瓶中，純化水定容。(7)配置空白溶液，在490 nm處校正儀器并測量吸光度。

1.3.2 多糖含量的測定

1.3.2.1 標準曲線的繪制

配制0、10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖系列標準溶液。用苯酚-硫酸法490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度(μg/mL)橫坐標，吸光值為縱坐標作圖，求得回歸方程為y=0.011x+0.0188，R2=0.9992。

1.3.2.2 地錦草多糖含量的測定

測定地錦草提取液中多糖的吸光度值，代入回歸方程計算多糖濃度，根據公式計算：多糖得率(mg/g)=c×V×n/W。式中：c為提取液多糖濃度，mg/mL；V為多糖提取液的體積，mL；n為稀釋倍數；W為地錦草粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 液料比對地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草5份，液料比分別為30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g，加入純化水，設定浸泡時間為60 min，微波時間為40 s，微波功率為240 W。

1.3.3.2 微波時間對地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草5份，設定微波時間為20、40、 60、 80、100 s，液料比為25∶1 mL/g，浸泡時間為60 min，微波功率為240 W。

1.3.3.3 微波功率對地錦草得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草粉末5份，設定微波功率為80、240、400、640、800 W，液料比為25∶1 mL/g，浸泡時間為60 min，微波時間為40 s。

1.3.3.4 浸泡時間對地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草粉末6份，設定浸泡時間為10、20、30、40、50、60 min，液料比為25∶1 mL/g，微波功率為240 W，微波時間為40 s。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，用D-E軟件處理數據，利用Box-Behnken中心組合試驗設計原理[5]，選取液料比(A)、微波時間(B)、微波功率(C)、浸泡時間(D)為試驗因素，以多糖得率為響應值，進行試驗設計，響應面因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對地錦草多糖得率的影響

見圖1。

圖1 液料比對地錦草多糖得率的影響

試驗表明，液料比的增加有利于地錦草中多糖得率的提高，液料比大于42∶1后，多糖得率反而有所降低。原因可能在于溶劑增多利于多糖擴散溶出，但是液料比繼續增加卻導致了其他雜質的溶出及部分多糖的分解。因此，液料比選在42∶1左右比較合適。

2.1.2 微波時間對地錦草得率的影響

見圖2。

試驗結果表明，適當增加微波輻射時間有利于地錦草中多糖得率的提高。當微波時間大于80 s時，多糖得率反而呈現下降趨勢。原因可能在于微波有利于細胞膜的破碎而使溶出物增多，但若輻射時間過長時，會使提取體系的部分區域超聲溫度瞬間上升，多糖分子鏈在高溫時發生分解。因此，微波時間選擇80 s左右較為合適。

圖2 微波時間對地錦草得率的影響

2.1.3 微波功率對地錦草得率的影響

見圖3。

圖3 微波功率對地錦草得率的影響

試驗結果表明，提高微波功率有利于地錦草中多糖得率的提高，但當微波功率高于640 W時，地錦草多糖的提取率反而呈下降趨勢。原因可能是提高微波功率有利于多糖破壁滲出擴散，但功率過大會使得供試液劇烈沸騰，液體從錐形瓶中溢出，同時對多糖的穩定性有一定影響，而使多糖得率降低。因此，微波功率選在640 W左右較為合適。

2.1.4 浸泡時間對地錦草多糖得率的影響

見圖4。

圖4 浸泡時間對地錦草得率的影響

試驗結果表明，浸泡時間延長有利于地錦草中多糖得率的提高，但浸泡時間大于32 min時，多糖的提取率反倒呈現下降趨勢。究其原因，可能是初始溶解時，多糖伸出兩較大，隨著時間的推移，多糖溶解達到飽和，而其他雜質溶解量則慢慢上升。因此，浸泡時間選在32 min左右較為適宜。

2.2 最佳提取工藝的研究

利用Box-Behnken組合設計原理，綜合單因素試驗考察結果，選取液料比、微波時間、微波功率、浸泡時間為自變量，以地錦草中多糖得率為響應值，稱取地錦草粉末1 g，共29份，設計四因素三水平共29個試驗點的響應面分析試驗。表2為試驗方案的設計和數據處理結果，表3為數據方差分析結果。

2.2.1 響應面試驗方案的設計和計算結果

見表2。

表2 響應面試驗設計和結果

2.2.2 響應曲面分析

對表2結果用D-E8.0軟件進行統計分析，得二次回歸方程模型為：

Y=-36.94083+0.67667A+1.11525B-0.080067C+0.93617D-0.0238AB+0.0015425AC-0.00905AD+0.000346875BC-0.0006875BD-0.00004CD+0.00933333A2-0.00236042B2-0.00000941667C2-0.00894167D2。回歸方程方差分析見表3。

表3 響應面試驗方差分析

注：*P值小于0.05為差異顯著；**P值小于0.01，表示差異非常顯著；***P值小于0.001，表示差異極為顯著。

從表3可知，模型回歸項F值為3.67，P﹤0.05，說明所選模型顯著。各因素的影響大小為液料比﹥微波功率﹥微波時間﹥浸泡時間，表中AB的P值小于0.01，說明它是較顯著的模型項。模型失擬項P﹥0.05不顯著，相關系數R2=0.783 4，調整系數RAdj2=0.552 6，表明試驗結果和數學模型擬合程度高，可用該模型預測試驗結果。CV(變異系數)=26.67%，說明模型精確度高，重現性好，試驗可信。

2.3 最佳工藝參數驗證性試驗

對提取率的回歸方程模型進行數據處理，得出地錦草中提取多糖的最佳工藝條件為：液料比配制為45 mL/g、微波時間設置為60 s、微波功率設置為483.6 W、浸泡26.2 min，多糖產率的預測值為16.02 mg/g。結合實驗室儀器參數，微波功率和微波時間只能設置為整數，最終確定實驗條件為：液料比45 mL/g、浸泡時間26 min、微波功率480 W、微波時間60 s。對修正參數下條件平進行3次重復驗證試驗，得地錦草中多糖的實際提取率為15.81 mg/g，與預測值(16.02 mg/g)相比較試驗的結果偏差較小，說明二次多項式數學模型進行等高線疊加所得到的優化區域符合設計目標，試驗設計和數學模型具有重現性，通過本試驗方法可以得到地錦草中多糖含量較高的提取工藝。

3 結論

筆者以地錦草為原料，用微波輔助法水提醇沉提取地錦草多糖。從單因素水平試驗可見：液料比為42∶1，微波時間為80 s，微波功率為640 W，浸泡時間為32 min時多糖得率分別最高。在此基礎上設計四因素三水平響應面分析法試驗，得出各因素對提取率的影響大小為：液料比﹥微波功率﹥微波時間﹥浸泡時間，最佳提取條件為液料比45 mL/g、微波時間60 s、微波功率483.6 W、浸泡26.2 min，多糖最佳提取率的預測值為16.02 mg/g。驗證性試驗進一步證明在液料比45 mL/g、浸泡時間26 min、微波功率480 W、微波時間60 s時，地錦草中多糖提取率達到15.81 mg/g。本試驗結果可為規模化提取地錦草多糖提供一定的參考，更優化的提取工藝及多糖的理化的性質均有待進一步的深入研究。