長柄扁桃不同提取物降血脂作用有效部位的篩選

白迎春，石松利，程向暉，王登奎，高晨

（1.包頭醫(yī)學院 藥學院，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學院 研究生學院，內蒙古 包頭 014040）

高脂血癥是脂質代謝或轉運異常，血清中膽固醇、甘油三酯和（或）低密度脂蛋白過高和（或）血清高密度脂蛋白過低的一種病[1-2]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，高脂血癥的發(fā)病率有明顯上升趨勢，高脂血癥發(fā)病率逐年上升，而且呈年輕化趨勢，嚴重威脅人們的身體健康[3]。高脂血癥已被證明是心腦血管疾病諸如高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、腦中風等的獨立危險因素，嚴重危害著人們的身體健康[4]。因此積極預防和治療高脂血癥有利于降低心血管病的發(fā)病率，而控制和調節(jié)血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）濃度是預防和治療高血脂病及其并發(fā)癥的關鍵。

長柄扁桃（Amygdalus pedunculatus Pall）是薔薇科（Rosaceae）桃屬（Amygdalus）扁桃亞屬（Amygdalus）落葉灌木，又名野櫻桃、柄扁桃、毛櫻桃，自然分布在我國西北干旱、半干旱地區(qū)山地和沙漠地帶[5-6]。長柄扁桃干燥成熟種子在中藥上又稱“郁李仁”[7]，有潤燥滑腸、利尿等功能，并且扁桃油中含有不飽和脂肪酸及α-VE等多種藥用成份，具有軟化血管、促進細胞再生、提高人體免疫力和抗癌、治癌的奇特功效[8]。長柄扁桃仁中含有植物中存在的18種氨基酸，總氨基酸含量為21.19%。各種氨基酸均具有重要的生理功能，因此富含這些氨基酸的長柄扁桃仁在人體內自然也具有相應的生理功能[9]。此外，候國峰等對陜西神木、內蒙古包頭、內蒙古阿拉善盟和河北承德4個不同產(chǎn)地長柄扁桃種仁一般成分、氨基酸、微量元素、脂肪酸及苦杏仁苷含量等進行分析，得出上述不同產(chǎn)地長柄扁桃種仁均富含粗脂肪（416 g/kg～478 g/kg）和粗蛋白（206 g/kg～286 g/kg） 及 Ca、Mg、P、Fe、K 等 9種對人體有益的礦質元素，未檢出 Pb、Cd、Hg、As 等元素[10]。

文獻報道已對長柄扁桃化學成分做了深入的研究，但對其降血脂有效部位研究較少，尚未見到對其不同部位脂代謝作用比較的研究。本課題組前期研究已證實長柄扁桃水煎液能調節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平，抵抗由高脂血癥引起的脂質過氧化、保護肝臟和降低發(fā)生心血管疾病的作用[11-12]。本研究在此基礎上，采用系統(tǒng)溶劑（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）分別對長柄扁桃進行提取，以高脂飼料復制高脂血癥大鼠模型，測定血清TG、TC、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）指標，觀察長柄扁桃藥材不同部位提取物對實驗性高脂血癥大鼠血脂水平的影響，確定長柄扁桃降血脂有效活性部位。

1 材料和儀器

1.1 藥材及樣品制備

長柄扁桃種仁采自包頭市固陽，經(jīng)內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院石松利教授鑒定為長柄扁桃，置于室內通風處曬干。長柄扁桃藥材加10 倍量體積的95%乙醇于 85℃～90℃水浴鍋中回流提取 2 次，2 h/次，過濾，再將濾渣以10 倍量體積70%乙醇于85℃～90℃回流提取1 次，2 h/次，合并濾液，減壓濃縮至膏狀，得粗提物。粗膏和蒸餾水1∶20（體積比）溶解分散，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，分散液和各萃取液的體積比為1∶1，合并各部位萃取液減壓濃縮至浸膏，水部位減壓濃縮至浸膏。4個部位得率分別為：石油醚部位25.42%、乙酸乙酯部位3.77%、正丁醇部位37.9%、水部位32.91%。各提取物浸膏，保存于-20℃冰箱，臨用前配置成所需濃度的藥液。

1.2 試劑與儀器

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鈉、羧甲基纖維素鈉：均為分析純，天津市開通化學試劑有限公司；血脂康膠囊（批號：20171134）：北京北大維信生物科技有限公司；牛膽鹽（批號：180208）、脫氧牛膽酸鈉（批號：180128）：北京科技鴻潤寶順科技有限公司；膽固醇（批號：20180311）：河南萬嘉生物科技有限公司；蛋黃粉（批號：20180318）：鄭州瑞林食品添加劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20180704）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20180705）：南京建成生物工程研究所；ALT、AST、ALP、TC、TG、HDL-C 和 LDL-C 等試劑盒：美國貝克曼公司。

高脂飼料的配制：基礎飼料77.3%、膽固醇2.0%、牛膽鹽0.5%、脫氧膽酸鈉0.1%、丙基硫氧嘧啶0.1%、蛋黃粉10%、豬油（豬油自制）10.0%，拌勻，加適量蒸餾水制成高脂飼料，烘干備用。

GZX-DHG 電熱恒溫鼓風干燥箱：山東濰坊醫(yī)療器械廠；DZW-8-8 型水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-52A 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GENIUS 5K-D 全自動脫帽離心機：長沙鑫奧儀器；Olympus AU640 全自動生化分析儀：日本奧林巴斯公司。

1.3 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠 70只，7 周齡，由北京大學醫(yī)學部（實驗動物科學部）提供，許可證號為SCXK（京）2011-0012，體重（170± 30）g。

2 方法

2.1 高脂模型建立及給藥干預

取Wistar 大鼠70只，采用分層隨機抽樣方法將大鼠分為7組，每組10只，各組平均重量相近。7組分別為正常對照組、高脂模型組、血脂康陽性藥組（0.108 g/kg）、石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組和水組。除正常對照組普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組喂高脂飼料，自由進食及飲水。實驗室溫度（25±5）℃，相對濕度（50±5）%。連續(xù)5 周后眶靜脈采血測血脂各項指標。從第6 周開始根據(jù)體質量（0.6 mL/100 g）進行灌胃，正常對照組、模型組給予生理鹽水，各給藥組分別給予1.5 g/kg（生藥量）。給藥期間，除正常對照組給予普通飼料外，其余各組給予高脂飼料，實驗期間自由攝食飲水。每周稱量體重1 次，根據(jù)體重變化調整給藥容積，連續(xù)灌胃5 周。

2.2 指標測定

實驗過程中，注意觀察動物生長情況，如精神狀態(tài)、活動、反應、胖瘦、食欲、大便等。給藥5 周，末次給藥后，禁食不禁水12 h，眶靜脈采血，離心分離血清，同時摘取肝臟并稱重。血清和臟器于-80℃保存，備用。采用測試盒測定血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、ALT 、AST 和 ALP 水平，同時計算肝臟系數(shù)、動脈硬化 指 數(shù)（arteriosclerosis index，AI）、HDL-C/TC 和SOD/MDA 比值。

2.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，實驗結果以表示，采用單因素方差分析（one-way-AVOVA）對各組均數(shù)進行比較，以p〈0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清血脂水平的影響

長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清血脂水平的影響結果見表1。

表1 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清血脂水平的影響（，n=10）Table 1 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum lipid level in hyperlipidemia rats

表1 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清血脂水平的影響（，n=10）Table 1 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum lipid level in hyperlipidemia rats

注：*表示與正常組比較p〈0.05，#表示與高脂模型組比較p〈0.05。

組別劑量/（g/kg）TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）正常 1.44±0.26# 0.99±0.40# 0.58±0.14# 0.54±0.03#高脂模型 5.07±0.54* 3.32±0.13* 1.03±0.15* 1.87±0.06*血脂康 0.108 4.16±0.35*# 0.42±0.03*# 1.26±0.09* 1.52±0.17*#石油醚 1.50 4.60±0.42* 3.04±0.03* 1.26±0.20* 1.75±0.04*乙酸乙酯 1.50 4.98±0.32* 3.10±0.13* 1.14±0.14* 1.85±0.11*正丁醇 1.50 4.14±0.24*# 0.37±0.02*# 1.28±0.14*# 1.61±0.09*#水1.50 4.77±0.68* 3.20±0.10* 1.20±0.16* 1.70±0.25*

給藥5 周后各組大鼠血清TC、TG 和LDL-C 含量顯著高于正常對照組（p〈0.05），說明高脂模型穩(wěn)定，造模成功。與高脂模型組比較，長柄扁桃正丁醇部位和血脂康組血清TC、TG 和LDL- C 顯著降低（p〈0.05），正丁醇部位 HDL-C 含量顯著升高（p〈0.05）；長柄扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位組血清TC、TG 和LDL-C 含量均有降低趨勢，但均無顯著性差異（p〉0.05），HDL-C 含量有升高趨勢，但無顯著性差異（p〉0.05）。

3.2 長柄扁桃提取物對高脂血癥血清SOD和MDA含量的影響

長柄扁桃提取物對高脂血癥血清SOD和MDA含量的影響結果見表2。

與高脂模型組比較，長柄扁桃石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、水部位和血脂康組的MDA 含量均降低，其中正丁醇部位和血脂康組差異有統(tǒng)計學意義（p〈0.05）；長柄扁桃石油醚部位、正丁醇部位和血脂康組的SOD均顯著升高，有統(tǒng)計學意義（p〈0.05）；長柄扁桃血脂康組和正丁醇部位的SOD/MDA 值均顯著升高，有統(tǒng)計學意義（p〈0.05）。

表2 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清SOD 和MDA 含量的影響（，n=10）Table 2 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on SOD and MDA content in serum of hyperlipidemia rats

表2 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清SOD 和MDA 含量的影響（，n=10）Table 2 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on SOD and MDA content in serum of hyperlipidemia rats

注：*表示與正常組比較p〈0.05，#表示與高脂模型組比較p〈0.05，▲表示與血脂康組比較p〈0.05。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）SOD/MDA正常 6.94±0.92*# 302.39±44.54▲ 42.12±9.16#高脂模型 12.99±1.90*▲ 296.64±11.98▲ 23.27±3.46*▲血脂康 0.108 8.08±2.15# 336.67±20.24*# 44.05±12.82*#▲石油醚 1.50 12.82±1.59*▲ 336.42±19.94*# 25.99±4.61*▲乙酸乙酯 1.50 10.94±1.22*▲ 310.55±40.94 28.33±5.54*▲正丁醇 1.50 10.32±1.18*# 326.10±10.32# 32.17±3.68*#▲水1.50 10.46±0.22* 284.34±23.97▲ 27.07±2.75*▲

3.3 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清ALT、AST、ALP和和肝臟系數(shù)的影響

長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清ALT、AST、ALP 和和肝臟系數(shù)的影響結果見表3。

表3 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清ALT、AST、ALP 和肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on ALT，AST，ALP and liver coefficients in serum of hyperlipidemia rats

表3 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清ALT、AST、ALP 和肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on ALT，AST，ALP and liver coefficients in serum of hyperlipidemia rats

注：*表示與正常組比較p〈0.05，#表示與高脂模型組比較p〈0.05，▲表示與血脂康組比較p〈0.05。

組別劑量/（g/kg）ALT/（U/L）AST/（U/L）ALP/（U/L）肝臟系數(shù)/（g/kg）正常 45.64±4.40# 82.73±9.36# 69.93±10.09 23.02±1.31#高脂模型 67.99±1.55*# 92.86±9.29* 148.47±6.36* 24.87±0.60*▲血脂康 0.108 55.57±7.24*# 82.25±12.53# 109.13±15.44*# 22.99±1.43#石油醚 1.50 65.33±1.65* 85.54±6.94 163.15±19.12* 24.83±1.08乙酸乙酯 1.50 64.6±4.82* 92.79±11.78 136.42±19.72*▲ 24.82±1.73正丁醇 1.50 62.07±3.49*#▲ 80.70±7.57# 117.6±6.42*# 22.82±0.43#水1.50 65.15±5.43* 82.76±12.84 108.47±13.50*# 25.00±0.92*▲

與高脂模型組比較，長柄扁桃正丁醇部位和血脂康組血清ALT、AST、ALP 和肝臟系數(shù)顯著降低（p〈0.05）；長柄扁桃石油醚部位和乙酸乙酯部位組血清AST、ALT 含量和肝臟系數(shù)均有降低趨勢，但無顯著性差異（p〉0.05）；長柄扁桃水部位組的血清 AST 、ALT 含量均有降低趨勢，但無顯著性差異（p〉0.05），ALP 含量顯著降低（p〈0.05）。

3.4 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠動脈硬化指數(shù)（AI）的影響

長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠AI 的影響結果見表4。

與正常組相比，高脂模型組血清HDL-C/TC 比值顯著降低（p〈0.05），AI 指數(shù)顯著增大（p〈0.05）。與高脂模型組比較，長柄扁桃正丁醇部位和血脂康組的血清HDL-C/TC 比值顯著增大（p〈0.05），AI 指數(shù)顯著降低（p〈0.05）；長柄扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位組的血清HDL-C/TC 比值均有增大趨勢，但無顯著性差異（p〉0.05）；長柄扁桃石油醚部位和乙酸乙酯部位組AI 指數(shù)均有降低趨勢，但無顯著性差異（p〉0.05）。

表4 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清AI 的影響（，n=10）Table 4 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum AI in hyperlipidemia rat

表4 長柄扁桃提取物對高脂血癥大鼠血清AI 的影響（，n=10）Table 4 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum AI in hyperlipidemia rat

注：*表示與正常組比較p〈0.05，#表示與高脂模型組比較p〈0.05，▲表示與血脂康組比較p〈0.05。

組別劑量/（g/kg）HDL-C/TCAI正常 0.40±0.06# 1.54±0.35#▲高脂模型 0.22±0.02* 3.77±0.32*▲血脂康 0.108 0.27±0.02*# 2.74±0.36*#石油醚 1.50 0.23±0.04* 3.50±0.30*乙酸乙酯 1.50 0.23±0.02* 3.72±0.34*正丁醇 1.50 0.25±0.03*# 2.87±0.30*#水1.50 0.23±0.03* 3.96±0.49*

4 結論與討論

高脂血癥又稱脂質代謝紊亂或異常，包括血清TC或TG 水平過高或HDL-C 水平過低。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立高脂血癥大鼠模型，造模5 周后，大鼠血清 TC、TG、LDL-C 和 HDL-C 含量均顯著升高，提示實驗性高脂血癥大鼠模型建立成功。模型組中HDL-C水平升高原因可能是高脂飼料中加丙硫氧嘧啶所造成的。丙硫氧嘧啶是甲狀腺激素抑制藥，有研究表明甲狀腺激素也可以通過調節(jié)SREBP-2 信號通路升高低密度脂蛋白受體（LDL receptor，LDLR）的表達水平從而降低血漿中LDL 的水平[13]。加入丙硫氧嘧啶造成血液中LDL 水平的升高，同時相應增加HDL 的水平，這可能是模型組HDL 水平增高的另外原因。實驗結果顯示灌胃給藥5 周后，4個提取部位對實驗性高脂血癥大鼠甘油三酯、膽固醇及極低密度脂蛋白均有影響。在降低甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白的作用中，長柄扁桃正丁醇提取部位同血脂康陽性藥的藥效相類似，可以顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG 和HDL-C 的含量，說明長柄扁桃正丁醇提取部位為最佳的降血脂有效活性部位。

MDA 是脂質過氧化反應鏈終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，可嚴重破壞細胞膜結構，檢測MDA 含量可以間接反映機體組織細胞的過氧化程度[14]。高脂模型組大鼠血清中MDA 含量顯著升高，體內出現(xiàn)嚴重脂質過氧化現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)血脂異常情況下會導致機體抗氧化能力下降，氧自由基生成增加，脂質過氧化作用增強。SOD 是機體細胞中主要抗氧化酶，能清除超氧陰離子使其生成過氧化氫，之后能被過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）分解為水和氧氣，是維持生物體自由基產(chǎn)生和過氧化物清除能力平衡的重要物質[14]。SOD/MDA 比值反映自由基引起的脂質過氧化和清除速率，該比值降低，表明機體自身調節(jié)無法維持氧化-抗氧化的動態(tài)平衡，機體產(chǎn)生脂質過氧化現(xiàn)象[15]。本實驗結果顯示，血脂康組和長柄扁桃正丁醇提取部位組能夠有效抑制高脂血癥大鼠血清中MDA 的升高、提高SOD 活力和SOD/NDA 比值，具有增強機體總抗氧化能力。

ALT 和AST 是最常用的肝臟功能的血清酶指標，血清中ALT 和AST 含量越高，表明肝細胞受損越嚴重[16-17]。本實驗高脂模型組血清中ALT 和AST 含量顯著升高，表明肝細胞受損。肝系數(shù)的增大往往伴隨著肝臟過氧化脂質、游離脂肪酸、血清ALT 和AST 升高等，從而引起肝細胞脂肪樣變，脂肪代謝紊亂，長期可能引起脂肪肝甚至肝硬化[18]。通過觀察各組肝系數(shù)可知，與正常組相比，模型組肝系數(shù)顯著升高，灌胃給藥后，長柄扁桃正丁醇部位肝系數(shù)顯著降低，表明對高血脂癥大鼠肝臟起到一定保護作用。ALP 是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，血清中的ALP 主要來自肝和骨骼[19]。ALP在血清中的含量與疾病性質、嚴重程度相關，ALP 偏高預示著肝臟異常。當肝臟受損傷或者障礙時經(jīng)淋巴道和肝竇進入血液，同時由于肝內膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。長柄扁桃正丁醇部位能顯著降低高脂血癥大鼠血清中的ALT、AST 和ALP 水平，使脂質代謝紊亂引起的大鼠肝臟損傷狀況好轉，對肝臟有一定的保護作用，這從另一方面說明正丁醇部位具有一定肝臟保護作用，而其具體作用機制尚待進一步的深入研究。

動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的疾病，高脂血癥能增加動脈粥樣硬化疾病發(fā)生的幾率。在血脂的幾個指標中LDL-C 對AS 的發(fā)生起著至關重要的作用，它可使膽固醇沉積于動脈血管壁上改變血管之韌性加速AS 的進程。HDL-C 主要將外周組織（包括血管）中的膽固醇及其酯運輸至肝臟代謝而排泄。現(xiàn)在已將降低血清LDL-C 和升高HDLC 作為防治的主要措施[20-21]。AS 的治療效果常以動脈硬化指數(shù)（AI）和 HDL-C/TC 比值為評判依據(jù)，AI 越低HDL-C/TC 比值越高均表示得到了良好的治療。從本實驗看出模型組的AI 明顯升高、HDL-C/TC 比值明顯下降。經(jīng)過給藥干預后，長柄扁桃正丁醇提取部位能顯著降低高脂血癥大鼠血清中AI 指數(shù)，顯著升高HDL-C/TC 比值，長柄扁桃正丁醇部位是預防動脈粥樣硬化形成的有效活性部位。

本研究結果表明，長柄扁桃正丁醇部位能顯著降低血清 TC、TG、LDL-C 水平、MDA 的含量、ALT、AST和 ALP 水平、肝系數(shù)及 AI 值（p〈0.05），能顯著提高SOD活性、SOD/MDA 和 HDL-C/TC 比值（p〈0.05），說明長柄扁桃藥材降血脂有效活性部位為正丁醇部位，為進一步開展長柄扁桃降血脂有效部位的量效關系及活性成分分離純化等研究和尋找其他高效無毒的降血脂藥物提供了實驗資料。