一個(gè)CRISPR/Cas9-VQR基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

陳 凱 孫國梁 宋高原 李愛麗 謝傳曉 毛 龍 耿帥鋒

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

作為新一代基因組編輯技術(shù), 與 ZFN (Zinc Finger Nucleases)、TALEN (Transcriptional Action Like Effector Nucleases)技術(shù)相比, 具有操作簡便、切割效率高、靶位點(diǎn)多等優(yōu)點(diǎn), 在模式植物和作物中得到廣泛的應(yīng)用[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在 gRNA的引導(dǎo)之下, 將Cas9帶到目的基因上, 利用RuvC和HNH切割DNA雙鏈, 形成雙鏈斷裂結(jié)構(gòu)(Double Strand Break), 然后生物體內(nèi)會(huì)在修復(fù)DSB過程中引起一些堿基的隨機(jī)插入或缺失, 從而產(chǎn)生移碼突變[2-3]。雖然CRISPR/Cas9相對(duì)于其他基因編輯技術(shù)具有較高的編輯效率, 但對(duì)不同物種或同一物種中不同基因的編輯效率卻不相同[4-5]。在擬南芥中, 研究人員以AtFT、AtSPL4、AtBRI1、AtJAZ1、AtADH1、AtFLS2和AtPDS3等為目的基因驗(yàn)證 CRISPR/Cas9的功能,其切割效率為1.10%～84.78%[6-10]。在煙草、水稻、大豆、西紅柿、高粱、玉米、棉花、小麥和藥用植物丹參中的切割效率分別為 1.8%～87.5%[6,11-13]、2.1%～100.0%[8,14-21]、14.7%～20.2%[22]、83.56%[23]、33.33%[24]、13.1%[25]、47.6%～81.8%[26]、5.6%[27]和 42.3%[28]。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道, 影響 CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的因素, 主要包括Cas9基因密碼子的優(yōu)化、Cas9基因啟動(dòng)子的替換、gRNA啟動(dòng)子的替換和gRNA的靶標(biāo)數(shù)目[29-32]。在擬南芥、煙草、番茄、大豆、水稻和玉米中, 都有優(yōu)化Cas9基因密碼子的報(bào)道, 但只有單子葉植物中的優(yōu)化能夠提高編輯效率[29,31]。利用植物內(nèi)源組成型啟動(dòng)子, 如 ZmUbi、OsUBQ和OsActin1, 啟動(dòng)Cas9基因, 也能獲得較高的編輯效率[15,30,33]。在單子葉植物中, 利用植物內(nèi)源的U6或者U3啟動(dòng)子啟動(dòng)gRNA更有利于基因編輯[31,34]。在擬南芥和玉米中, 串聯(lián) 2個(gè)gRNA比單個(gè) gRNA的編輯效率高[31-32]。在水稻中, 分別設(shè)計(jì) 1、2、3個(gè) gRNA靶向一個(gè)基因, 結(jié)果表明靶向同一個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)時(shí)編輯效率提高[35]。另外,CRISPR/Cas9的PAM位點(diǎn)NGG, 也在一定程度上限制了其使用范圍。雖然在……