南極假絲酵母脂肪酶B在離子液體/超臨界流體體系中的穩定性模擬

張靜曉，張麗雷*，劉曉潔，吳小亮，徐 璐

1湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，恩施 445000;2湖北民族學院化學與環境工程學院，恩施 445000

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)具有寬泛的底物特異性、高活性、高對映選擇性、以及在水和非水環境中的穩定性，是生物技術中非常重要的酶，在酯交換、動力學拆分和聚合反應中均有廣泛應用[1,2]。目前，在離子液體(IL)和超臨界流體(SCF)組成的兩相體系中進行CALB催化反應是研究的熱點[3-5]。在此兩相體系中，IL提供催化反應的溶劑環境，能夠提高蛋白酶的活性、穩定性和選擇性，并且相較于其它有機溶劑更好地保護了蛋白酶的二級結構[3,6-8]；而SCF可降低IL的黏度，促進反應底物的運輸，加快反應的進行，并可同時將反應產物從IL相中萃取出來，解決了反應之后需要使用易揮發性有機物進行萃取而產生的污染問題[9,10]。然而，由于IL和SCF形成的兩相體系較復雜，IL和SCF的性質以及兩相的平衡關系均會影響到蛋白質的結構穩定性，從而影響其活性，因此從原子尺度揭示此兩相體系性質對CALB結構穩定性的影響可為開發高效的IL/SCF兩相溶劑體系，以及兩相體系狀態的控制提供重要參考。

分子動力學模擬可以獲取在實驗中難以獲得的空間和時間尺度上生物分子系統的行為和性質[11,12]，是從原子尺度研究溶劑運動對蛋白結構產生影響的有效方法。為了深入理解IL/SCF溶劑體系對CALB蛋白酶結構穩定性的影響，本文采用分子動力學方法，構建了新型離子液體三丁基十四烷基季磷十二烷基苯磺酸鹽(CYPHOS IL-201)與無極性的超臨界CO2流體形成的兩相體系和CYPHOS IL-201與具有較大極性的超臨界CHF3流體形成的兩相體系，研究CALB在這兩種兩相體系中的結構和性質，揭示這兩種溶劑環境性質對CALB結構穩定性的影響。

1 分子動力學模擬方法

1.1 分子動力學模型的構建

從RCSB PDB數據庫中選擇CALB蛋白晶體結構(PDB ID：5a71)作為CALB蛋白的模擬模型，此結構是迄今為止分辨率最高的CALB蛋白晶體模型[13]。

構建的典型分子動力學初始模型如圖1所示。CALB蛋白晶體置于邊長約為11nm的立方體CYPHOS IL-201離子液體相中，離子液體相模型包含880個三丁基十四烷基季磷陽離子和880個十二烷基苯磺酸陰離子，在立方體離子液體相上下位置擴展出5 nm的區域，并置入20 000個超臨界流體分子(CO2或者CHF3)，體系約含有20萬個原子。模擬過程中采用周期性邊界，經等溫等壓系綜(NPT系綜)模擬后，體系密度收縮至約為CYPHOS IL-201離子液體密度的實驗值。

本文構建了五種溶劑體系，包括：超臨界CO2流體(ScCO2)、超臨界CHF3流體(ScCHF3)、離子液體CYPHOS IL-201(IL)、離子液體CYPHOS IL-201/超臨界CO2兩相體系(IL/ScCO2)、以及離子液體CYPHOS IL-201/超臨界CHF3兩相體系(IL/ScCHF3)。分別對比了CALB蛋白在這五種溶劑體系中的行為和性質。

圖1 分子動力學模型Fig.1 The model of molecular dynamics

1.2 分子動力學模擬條件

所有模擬均在GROMACS程序包(版本2016.3)中進行，對CALB蛋白質采用Amber99sb-ildn力場，3點水模型。對離子液體和超臨界流體分子采用GAFF力場和AM1-BCC電荷。在IL/ScCHF3兩相體系中溫度為55 ℃，壓力30MPa，其他體系中溫度為65 ℃，壓力20 MPa。實驗研究表明，CALB在此條件下催化活性較好[4]。

對構建的五個體系分別進行三個階段的模擬，首先采用最陡下降法將每個系統中的溶劑分子進行能量極小化。第二階段，進行限制性動力學模擬，保持蛋白分子固定，離子液體和超臨界流體的分子自由移動，并將體系緩慢加熱加壓至指定溫度和壓力條件，使體系密度收縮至約為CYPHOS IL-201離子液體的實驗密度值，并達到平衡狀態。第三階段進行平衡狀態的模擬，每個系統均采用0.2 fs的時間步長，分別進行20 ns的分子模擬。為了在模擬過程中保持不同組分的恒定溫度和壓力，使用V-rescale方法控制溫度，使用Parrinello-rahman方法控制壓力。對于系統的每個組件，應用PME算法估計靜電相互作用。

2 結果與討論

考察了所構建的五個體系在模擬過程中的全體系均方根偏差(RMSD)值，結果如圖2所示，從圖中可見，經過5ns的模擬后，五個體系均達到了平衡狀態。

圖2 體系在模擬過程中的RMSD值Fig.2 RMSD values of systems during simulation

圖3 CYPHOS IL-201/ScCO2兩相體系中的原子數密度分布Fig.3 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCO2 two-phase system

為了考查所研究的體系中離子液體CYPHOS IL-201和超臨界流體(CO2、CHF3)形成兩相的行為，將5ns至20ns范圍內，每隔0.1ns取一幀，統計了IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個體系中三丁基十四烷基季磷陽離子、十二烷基苯磺酸陰離子、以及超臨界流體分子在以CALB蛋白中心為中心，Z軸方向上的原子數量密度分布，并取平均值，結果如圖3和圖4所示。

圖4 CYPHOS IL-201/ScCHF3兩相體系中的原子數密度分布Fig.4 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCHF3 two-phase system

從圖3和圖4中可見，CALB蛋白處于離子液體相中，并且沒有向超臨界液體相移動的趨勢。另外，離子液體CYPHOS IL-201中的三丁基十四烷基季磷陽離子和十二烷基苯磺酸陰離子主要分布在CALB蛋白的周圍，只有極少部分分布在超臨界流體相中。超臨界流體分子有少部分進入了離子液體相中，大部分分布在離子液體的周圍，與文獻報道離子液體和超臨界流體的行為一致[14]。此結果表明在所研究的溫度和壓力下，離子液體CYPHOS IL-201可分別與超臨界CO2流體和超臨界CHF3流體形成具有相互作用的兩相體系。

對比IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個溶劑體系的行為可見，離子液體CYPHOS IL-201和ScCO2形成的兩相界面較ScCHF3更為明顯，說明與ScCO2相比，ScCHF3更容易進入到CYPHOS IL-201離子液體相中，而CYPHOS IL-201也更易分布于ScCHF3流體中。由于超臨界流體可以降低離子液體的濃度和黏度，提高反應底物在離子液體相中的運輸能力，從而提高酶催化反應的效果，而CHF3具有較CO2更易溶解于CYPHOS IL-201相的能力，從而通過控制溫度和壓力可能具有更好地提高酶催化反應的能力。

蛋白質原子位置的均方根偏差(RMSD)和時間的函數是反映蛋白質結構穩定性的重要指標15。RMSD是通過蛋白結構與其參考結構的最小二乘法擬合得到，定義如式(1)所示。

(1)

其中，N是體系原子的總數目，ri和ri,ref是蛋白原子分別在考察結構和參考結構中的位置。

圖5為CALB蛋白在所考察的五個溶劑體系中運動軌跡的RMSD計算結果。從圖中可見，CALB蛋白在ScCHF3流體中非常不穩定，RMSD值變化劇烈，這有可能是因為CALB蛋白在ScCHF3中產生了蛋白質變性[6]。而CALB蛋白在ScCO2流體中RMSD值比較平穩，結構相對穩定，表明具有較大極性的CHF3更容易與CALB蛋白發生相互作用，使其結構發生變化，以致失去催化活性。另外，CALB蛋白在IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三個溶劑體系中的RMSD值在模擬過程中變化很小，最后上下波動在0.05 nm左右，表現出了良好的穩定性。對比CALB蛋白在ScCHF3和在IL/ScCHF3兩相體系中的結果可見，離子液體CYPHOS IL-201起到了穩定CALB蛋白結構的作用，與文獻報道CALB在IL/ScCHF3兩相體系中可表現出良好的催化活性的結果一致[4]。

圖5 CALB蛋白在模擬過程中的RMSD值Fig.5 RMSD values of CALB protein during simulation

蛋白質的均方根波動數值(RMSF)是衡量蛋白質原子在整個軌跡中相對于平均位置波動的程度，計算方法如式(2)所示。

(2)

對CALB蛋白的各個殘基在五個溶劑體系中的RMSF值進行了計算，結果如圖6所示。從圖中可見，CALB在ScCHF3流體中殘基波動較大，可能已經發生了蛋白質的變性，與前述RMSD的考查結果一致。CALB蛋白的RMSF值在ScCO2和IL/ScCO2兩個體系中最為穩定，表明CO2的存在沒有增加CALB蛋白殘基的柔性。在IL體系和IL/ScCHF3體系中，CALB蛋白的部分殘基表現出了較大的柔性，但是柔性部位并不相同，這是由于CYPHOS IL-201和ScCHF3與CALB蛋白的殘基之間產生了相互作用[3,16]。另外，CALB蛋白的催化主要由蛋白中保守的Ser105-Asp187-His224三聯體負責[17]。在這四個體系中，這三個殘基均未出現明顯的波動情況，這也是在這三個體系中CALB表現出良好的催化性能的原因[4]。

另外，對比IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個體系中蛋白的RMSF值發現，殘基140至150區域內，IL/ScCHF3體系中蛋白的RMSF值發生較大變化，這是由于CHF3與此區域的α螺旋結構發生氫鍵相互作用，破壞了維持α螺旋結構的N-H…O氫鍵。CHF3易破壞α螺旋結構從而破壞蛋白結構，設計新型離子液體對α螺旋結構進行保護是提高蛋白穩定性的可行方法。

回轉半徑(Rg)是描述蛋白質結構平衡構型的重要參數，是蛋白質結構緊密性的重要指標，可用式(3)表示。

(3)

其中，mi是原子i的質量，是原子i相對于蛋白質質量中心的位置。對所研究的五個體系中的CALB蛋白在模擬過程中的回轉半徑進行了計算，結果如圖7所示。

圖7 CALB蛋白在模擬過程中的回轉半徑Fig.7 Radius of gyration values of CALB protein during simulation

從圖7中可見，由于CALB蛋白在ScCHF3溶劑體系中可能出現了蛋白的變性，導致其回轉半徑變得較大。在其他四個溶劑體系中，CALB蛋白的回轉半徑較小，并且較為接近。其中，CALB蛋白在CYPHOS IL-201離子液體中的回轉半徑最小，其結構最為緊湊，與前述CYPHOS IL-201離子液體有保護蛋白結構作用的結論一致。在ScCO2體系里，CALB蛋白回轉半徑有所增大，但并不明顯，然而這也有可能會導致蛋白酶催化作用失活。這也可能是文獻報道CALB蛋白在ScCO2體系中一段時間后，就出現了催化活性降低的原因[18]。另外，通過對幾個體系中蛋白與超臨界流體之間的作用力分析發現，蛋白與CHF3之間的靜電作用力較CO2的靜電作用力大，是影響蛋白穩定性的主要作用力。

圖8 CALB蛋白在模擬過程中的二級結構平均含量Fig.8 Average contents of secondary structure of CALB during simulation

為了進一步闡明在所研究的溶劑體系中CALB蛋白酶的構象變化，考查了CALB蛋白酶二級結構在模擬過程中的平均含量，結果如圖8所示。從圖8中可見，CALB蛋白在ScCHF3溶劑體系中，二級結構出現了明顯的改變，表明CALB蛋白可能出現了變性，與前述研究結果一致。另外，CALB蛋白在IL和IL/ScCO2體系中二級結構基本沒有發生明顯的變化，與文獻報道CALB蛋白在這兩個溶劑體系中的穩定性良好的結果一致[8,10,12]。

對比CALB蛋白在IL體系和ScCO2體系中的二級結構可見，當酶溶解在ScCO2中時，發生有序二級結構(α-螺旋、β-折疊和轉向)和無序二級結構(卷曲)的顯著畸變，表明ScCO2對CALB蛋白酶也具有變性作用。有許多實驗研究與上述理論研究結果一致。例如，通過圓二色性光譜研究，Ishikawa等人在35 ℃和25 MPa條件下的ScCO2中處理脂肪酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和葡糖淀粉酶，發現酶中的α-螺旋的含量分別降低62.9%、31.3%、37.6%和12.4%，并且酶的活性還與剩余的活性α-螺旋殘基之間存在線性關聯[19]。可見蛋白質有序二級結構的減少是蛋白質的活性和穩定性減弱的主要原因，穩定其二級結構可獲得較好的活性和穩定性。文獻[20]的實驗研究也獲得了類似的研究結果。在本文所研究的體系中，IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三個溶劑體系中CALB蛋白的有序二級結構的減少最少，推測其具有最好的活性和穩定性。

3 結論

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)是生物技術中非常重要的酶。采用離子液體和超臨界流體形成的兩相體系可為其催化反應提供一個綠色高效的溶劑體系。本文通過分子動力學方法研究了CALB蛋白酶在新型離子液體CYPHOS IL-201分別和具有極性CHF3以及無極性的CO2兩個超臨界流體形成的兩相體系中的結構和性質。結果發現，離子液體CYPHOS IL-201和超臨界流體CHF3及CO2均能形成兩相體系，具有明顯的相界面，CALB蛋白始終處于離子液體相中，具有極性的CHF3分子較無極性的CO2分子更易進入離子液體相，從而降低離子液體相的濃度和黏度。通過對CALB在模擬體系中的RMSD、RMSF、Rg、以及二級結構的分析發現，在超臨界CHF3流體中，CALB蛋白發生變性是其失活的主要原因；在超臨界CO2流體中，CALB蛋白的結構緊密性降低，有序二級結構減少是蛋白穩定性下降的主要原因。CHF3易破壞維持CALB蛋白α螺旋結構的N-H…O氫鍵是其導致蛋白結構不穩定的主要因素。離子液體CYPHOS IL-201起到了保護蛋白結構的作用，在離子液體CYPHOS IL-201與超臨界流體(CHF3、CO2)形成的兩相體系中，CALB蛋白結構較為穩定是其具有較好催化活性的主要原因。通過調整超臨界流體分子的極性，一方面保證降低離子液體粘度的程度，另一方面保護蛋白結構的穩定性，有助于獲得更好的催化活性。