廣東石豆蘭多糖的提取工藝及其抗氧化活性

苗永美，孫佳琦，徐榮華，汪 雁

安徽科技學院生命與健康科學學院，鳳陽 233100

石豆蘭屬(Bublophyllum)為蘭科最大的屬，該屬植物全世界約有1 000種，主要分布于亞洲、非洲和美洲熱帶地區。我國有一百多種，主要產于長江流域及其以南各省區，尤以云南南部為多[1]，也有新種逐漸被發現的報道[2,3]。石豆蘭屬植物中有些種類是中草藥，常作民間藥用的有15種，包括廣東石豆蘭、麥斛等[1]。石豆蘭以全草或假鱗莖或鮮草入藥，具有清熱、滋陰、消腫、抗癌、抗焦慮等功效[4]。

植物多糖因有增強和調節機體免疫功能，抗衰老，抗腫瘤，抗輻射等作用而受到廣泛的重視[5]。蘭科植物中石斛、天麻、白芨、芋蘭、杜鵑蘭、石豆蘭等都是重要中藥材，多糖是其主要藥用成分之一。關于蘭科植物多糖的研究，不同植物開展的廣度和深度不同，石斛[6]、白芨[7]、金線蓮[8]、石仙桃[9]、天麻[10]等植物體內多糖的研究比較多。石豆蘭的研究相對較少，僅對其資源調查[1]、顯微結構特征[11]、非多糖化學成分的分離鑒定[12]、藥理[13]等幾個方面有少量研究，關于石豆蘭多糖的研究尚未見報道。

植物多糖的提取多采用水提法。趙會然等[14]對云南產的五種蘭科植物滇西貝母蘭(Coelogynecalcicola)；喉紅石斛(Dendrobiumchristyanum)；密花毛蘭(Erispicata)；鐮翅羊耳蒜 (Liparisbootanensis)；溫氏卷瓣蘭 (Bulbophyllumwendlandianum)中的多糖采用傳統水提法，苯酚-硫酸法檢測，方法穩定、重復性好，并優化了溫度、料液比和提取時間等工藝參數。因此本研究采用水溶劑提取、苯酚硫酸法檢測，在單因素試驗的基礎上進行正交設計，考察液料比、提取溫度和時間及沉淀多糖的乙醇濃度對多糖提取量的影響。并對廣東石豆蘭粗多糖的總還原力、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率、Fe2+螯合率進行測定，評價其抗氧化活性。旨在為石豆蘭功能性食品開發和利用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石豆蘭鮮樣，經形態學鑒定屬于廣東石豆蘭(Bublophyllumkwangtungense)，采自福建屏南鴛鴦獼猴自然保護區。

濃H2SO4、苯酚、葡萄糖、氯仿、異戊醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、L-抗壞血酸、甲醇、乙醇、DPPH、FeSO4、水楊酸、H2O2、Tris、濃HCl、鄰苯三酚、菲啰嗪、EDTA。

1.2 儀器

DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信試驗儀器有限公司)、QE-100中草藥粉碎機(浙江屹立工貿有限公司)、水浴鍋(上海司樂儀器有限公司)、R205B旋轉蒸發器(上海申順生物科技有限公司)、ThermoHeraeus Multifuge X1R冷凍離心機、FD-ID-80冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)、T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取工藝流程

鱗莖洗凈、切片、50 ℃烘干 → 粉碎過60目篩 → 干粉 → 熱水浸提液 → 離心、取上清液 → 濃縮 → 低溫醇沉過夜 → 沉淀溶解 → Sevage法去蛋白 → 多糖溶液→冷凍干燥 → 粗多糖。

1.3.2 多糖含量的測定

表1 標準曲線的繪制

采用趙會然的苯酚—硫酸法[14]，體系略作改動，具體見表1，490 nm處測其吸光度值，繪制標準曲線得回歸方程A=0.01C-0.029，R2=0.996 4。

樣品液按上面步驟得糖濃度，按下式計算多糖提取量：

多糖提取量(mg/g)=(C×V×N)/1 000M

式中：C—多糖濃度(μg/mL)，V—提取液總體積(mL)，N—稀釋倍數，M—干粉重量(g)。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取干粉1.0 g，分別考察液料比、提取溫度、提取時間和醇沉濃度4個因素對多糖提取的影響，每個實驗重復三次。

1.3.3.1 液料比的選擇

按液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1加入蒸餾水，80 ℃水浴提取3 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.2 提取溫度的選擇

按液料比60∶1加入蒸餾水，分別在60、70、80、90、100 ℃下水浴提取3 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.3 提取時間的選擇

按液料比60∶1加入蒸餾水， 90 ℃下水浴提取2、3、4、5、6、7 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.4 醇沉濃度的選擇

按液料比60∶1加入蒸餾水， 90 ℃下提取6 h得多糖提取液，加入乙醇使終濃度分別達到70%、75%、80%、85%、90%、95%，冰箱沉淀過夜。

1.3.4 多糖提取的正交試驗

據單因素試驗結果，選擇液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C )、醇沉濃度(D)合適水平，以多糖提取量為指標，進行L9(34)正交試驗設計，對多糖的提取工藝進行優化，確定最佳工藝條件。

表2 L9(34)正交試驗因素與水平

1.3.5 換算因子的計算

醇沉、離心后得到的濕多糖經冷凍干燥，得干品，配成1 mg/mL的多糖原液，稀釋成100 μg/mL，按標準曲線操作步驟得葡萄糖濃度，按下列公式計算換算因素：F=C0/C1。

C1—按方程得出的葡萄糖濃度；C0—配制的多糖濃度。經計算得：F=100 μg/mL/36.73 μg/mL=2.72

1.3.6 抗氧化活性的測定

配制100 mg/mL的廣東石豆蘭多糖溶液，稀釋成100、200、300、400、500 μg/mL五個濃度梯度(編號1～5)，通過五個指標對石豆蘭多糖抗氧化活性進行評價。

1.3.6.1 總還原力測定

還原力測定參考Apati等的方法[15]，略作調整。取1～5號樣品液1 mL于試管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS(pH6.6)和1%鐵氰化鉀， 50 ℃水浴20 min，取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，搖勻、離心，吸取3.5 mL上清液加入新試管中，再加0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液搖勻，靜置4 min，測700 nm吸光度值；以相同濃度的L-抗壞血酸做陽性對照。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除測定參考Hatano等的方法[16]，略作調整。各試管中分別加入1～5號樣品液2.0 mL，再依次加2 mL的DPPH(0.2 mmol/L)，暗反應30 min，測定517 nm的吸光度值，記A1；用甲醇代替DPPH測定樣品的本底吸收，記A2；用蒸餾水代替樣品作空白對照，記A0；L-抗壞血酸做陽性對照，濃度梯度為樣品的1/10(編號1-5)，平行3次，計算清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.6.3 羥基自由基清除能力測定

各管中分加入1～5號樣品液1.0 mL，再加 9 mmol/L FeSO41 mL，反應15 min后加9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O21 mL，37 ℃反應30 min，測510 nm的吸光度值，記A1；用蒸餾水代替H2O2測定樣品的本底吸收值，記A2；以蒸餾水代替樣品，記A0；相同濃度的L-抗壞血酸做陽性對照；平行3次，計算清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.6.4 超氧陰離子清除能力測定

各管中分加入1～5號樣品液1.0 mL，再分別加50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)3 mL，37 ℃水浴20 min，立即加37 ℃預熱的7 mmol/L鄰苯三酚1 mL，迅速搖勻倒入比色皿，325 nm處每30 s測吸光度值，連測4 min，計算每分鐘變化值，記A1；蒸餾水代替樣品，增加值記A0；以1/4樣品濃度的L-抗壞血酸為陽性對照(編號1-5)；平行3次，計算清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

1.3.6.5 Fe2+螯合率測定

各管中分加入1～5號樣品液1.0 mL，加0.1 mL 1 mmol/L 的FeSO4搖勻，靜止15 min，加入0.2 mL 菲啰嗪(2.5 mmol/L)、3.7 mL蒸餾水，室溫放置20 min，562 nm處測吸光值，記A1；用蒸餾水代替菲啰嗪，記A2；蒸餾水代替樣品，記A0； 以1/10樣品濃度的EDTA做陽性對照(編號1-5)；平行3次，計算Fe2+螯合率 (%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.7 數據處理

數據分析用Excel2010和SPSS19.0，繪圖采用Origin2018軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對多糖提取量的影響

從圖1看出，多糖提取量隨液料比增大呈先升后降趨勢，在液料比20∶1時，多糖提取量僅為25.10 mg/g，多糖得率隨液料比增大迅速增加，增加到60∶1時最高(65.40 mg/g)，主要是大的溶劑量增加了物料與溶劑的接觸面積、溶液傳質推動力和濃度梯度，促使細胞壁破裂，多糖得以釋放。當超過60∶1時，多糖提取率出現緩慢下降趨勢，可能是多糖溶出已達飽和，增加溶劑量，不僅消耗能源，且后續純化濃縮難度增加，導致多糖的損失增大。綜合考慮，選擇液料比60∶1(mL/g)更為合適。

圖1 液料比對多糖提取量的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid on polysaccharide yield

2.1.2 提取溫度對多糖提取量的影響

從圖2看出，60～90 ℃范圍內，多糖浸提量逐漸升高，可能是因為高溫加快了溶劑的滲透和溶質的擴散，利于多糖的溶出，90 ℃時提取量最高(69.92 mg/g)；但隨著溫度繼續升高，多糖提取量反而下降，可能由于過高的溫度加大了蛋白質凝固使多糖不易溶出，或者部分多糖發生了水解，又增加了雜質的溶出量。因此，溫度以90 ℃為最佳。

圖2 提取溫度對多糖提取量的影響Fig.2 Effect of extracting temperature on polysaccharide yield

2.1.3 提取時間對多糖浸提量的影響

由圖3得知，多糖提取量隨著時間延長而升高，5 h后迅速增加，6 h時最高(74.99 mg/g)；時間過長不利于多糖的提取，可能是因為提取早期多糖的擴散速率逐漸增大，隨著溶質在兩相中濃度梯度差減小，擴散速度會越來越慢，待達到飽和后，多糖含量不再增加，如果繼續加熱提取，多糖會發生縮合、降解、氧化等化學反應，此外原料中的凝固蛋白質也不利于多糖的溶出，最終導致多糖得率下降。因此，提取時間6 h為宜。

圖3 提取時間對總黃酮浸提量的影響Fig.3 Effects of extracting time on polysaccharide yield

2.1.4 醇沉濃度對多糖提取量的影響

從圖4看出，隨著沉淀多糖所用乙醇濃度的提高，多糖得率逐漸升高，當乙醇濃度超過80%時，多糖得率增加緩慢，95%醇濃度沉淀出的多糖比90%醇濃度只增加了3.19%，因此，選擇90%～95%的乙醇濃度沉淀石豆蘭多糖均能得到理想結果。

圖4 醇沉濃度對多糖提取量的影響Fig.4 Effect of the alcohol concentration on polysaccharide yield

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果與分析

根據表3中R值大小可知，對多糖提取率的影響程度依次為：提取時間>提取溫度>醇沉濃度>液料比，最佳提取工藝為A1B2C2D3，即液料比為50∶1(mL/g)，溫度為90 ℃，時間為6 h，醇沉濃度為95%。方差分析結果(表4)顯示，四個因素的F值均大于F0.01，說明四個因素對多糖提取率的影響都達到了極顯著水平。

表3 L9(34)正交試驗結果

表4 方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00。

Note：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00.

2.2.2 最優工藝的驗證性

按照正交設計優化出的最佳工藝條件A1B2C2D3進行提取，平行三次，結果見表5，多糖平均提取率為79.060 mg/g，RSD 值為0.132%(n=3)。計算結果表明，該提取工藝穩定可行。

2.3 多糖的抗氧化性

2.3.1 總還原力

以L-抗壞血酸為對照，測定廣東石豆蘭多糖的總還原力，結果見圖5。總還原力隨多糖濃度增加而升高，但低于同濃度的L-抗壞血酸，還原力為0.5對應的多糖和L-抗壞血酸質量濃度A0.5分別是5 061、174.87 μg/mL，其還原力為L-抗壞血酸的3.46%。總還原力是反映潛在抗氧化活性的重要指標，由此可見廣東石豆蘭多糖的還原力較小。

表5 驗證性試驗

圖5 多糖的總還原力Fig.5 Total reducing power of polysaccharide

2.3.2 對DPPH自由基的清除能力

多糖和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力如圖6所示，隨著濃度的升高，清除率都呈上升趨勢，但多糖上升緩慢，500 μg/mL比100 μg/mL的多糖對DPPH自由基清除率只提高了26.44%，大大

圖6 多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacity to DPPH free radical of polysaccharide

低于陽性對照，多糖和L-抗壞血酸對DPPH自由基清除率達到50%時所需的效應濃度(EC50)分別為2769.58、18.80 μg/mL，得出多糖清除DPPH自由基的能力是L-抗壞血酸0.68%。

2.3.3 對羥基自由基的清除能力

多糖對羥基自由基清除能力如圖7所示，隨濃度增大，清除能力逐漸增強，基本呈線性增長；多糖和L-抗壞血酸對羥基自由基的EC50分別為 594.60、280.49 μg/mL，得出多糖清除羥基自由基的能力是L-抗壞血酸的47.17%。

圖7 多糖對羥基自由基的清除效果Fig.7 Scavenging capacity to hydroxy free radical of polysaccharide

2.3.4 對超氧陰離子清除能力

多糖對超氧陰離子清除能力如圖8所示，隨著濃度的增大，清除率逐漸提高，多糖的清除率稍高于1/4相同濃度的L-抗壞血酸的清除率，多糖和L-抗壞血酸對超氧陰離子的EC50分別為 586.94、170.20 μg/mL，得出多糖對超氧陰離子的清除能力是L-抗壞血酸的29.00%。

2.3.5 對Fe2+的螯合能力

如圖9所示，多糖對Fe2+有一定的螯合能力，隨著濃度升高，對Fe2+的螯合能力逐漸增強，當濃度達到300 μg/mL后，螯合能力上升減緩；所試的濃度范圍內，多糖的螯合率低于1/10相同濃度EDTA的螯合率；多糖和EDTA對的Fe2+的螯合率EC50分別為 160.83、3.41 μg/mL，得出多糖對Fe2+的螯合力是EDTA的2.12%。

圖8 多糖對超氧陰離子的清除效果Fig.8 Scavenging capacity to superoxide anion of polysaccharide

圖9 多糖對Fe2+的螯合率Fig.9 Chelating rate to Fe2+ of polysaccharide

3 結論

本試驗在參考前人研究基礎上選用熱水法提取石豆蘭多糖，采用單因素結合正交試驗設計，四個因素對多糖的提取率的影響依次為提取時間>提取溫度>醇沉濃度>液料比，正交試驗優化出的最佳工藝為A1B2C2D3，即液料比為50∶1(mL/g)，提物溫度為90 ℃，提取時間為6 h，醇沉濃度為95%，此工藝下，多糖的提取量為79.060 mg/g，RSD值為0.132%。

石豆蘭多糖具有一定的抗氧化能力，總還原力為L-抗壞血酸的3.46%；清除DPPH自由基的能力較弱，清除羥基自由基和超氧陰離子的能力相對較強，清除能力分別是L-抗壞血酸的0.68%、47.17%和29.00%；對Fe2+的螯合能力是EDTA的2.12%。