新疆棉田根際土壤真菌熒光PCR技術定量及其時空動態分析

黨文芳，李雪艷，楊紅梅，楚 敏，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫爾，李玉國，婁 愷，史應武,3,4

(1.新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院微生物應用研究所 ,烏魯木齊830091；3.新疆特殊環境微生物實驗室,烏魯木齊 830091；4.農業農村部西北綠洲農業環境重點實驗室,烏魯木齊830091)

0 引 言

【研究意義】真菌作為構成土壤微生物群落的重要組成部分之一，同時作為土壤中大部分微生物生物量的來源[1]，再加上棉花黃萎病是一種土傳真菌引起的病害，所以土壤真菌的種類、定殖率和定殖量等因素都將成為直接影響真菌對宿主植物效應的關鍵因素。新疆棉花黃萎病的加劇成為制約新疆棉田產量及棉花纖維品質的因素之一。棉花黃萎病是一種土傳真菌病害，目前，用于防治棉花黃萎病報道最多也最有發展前景的防治辦法為生物防治。了解新疆棉田根際土壤微生物動態變化對于生防微生物的篩選及其應用都能提供很好的理論依據。棉花黃萎病根際土壤真菌定量分析對揭示棉花根際土壤真菌影響黃萎病發生、以及微生態調控黃萎病具有重要意義。【前人研究進展】劉會梅等[2]評價了傳統的土壤真菌分離和計數方法：分離工作量大，耗時多；直接計數法估計的真菌總數低于實際存在，間接計數法存在不能區分這些真菌是死菌還是活菌的問題，不能全面反映土壤真菌的實際情況。顧美英等[3]以棉田黃萎病發病植株與健康植株根際土壤作為對象，以稀釋平板法研究了根際土壤微生物的數量變化情況。高峰等[4]利用巢式PCR技術對土壤中病原菌進行了初步定性檢測，而對于定量還未做具體研究。有關分子生物學的很多方法在細菌檢測中應用的很多，而在真菌中應用的則相對較少[5]。隨著 PCR 技術的不斷發展應用[6-7]，植物各組織中內生真菌的含量測定已多采用實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)法[8-11]，結果顯示，該方法可以實時的對內生真菌的變化情況進行較全面的分析。2011 年，肖蕊等[11]用SYBR Green I 熒光定量 PCR 檢測方法對土壤中棉花黃萎病病原菌進行定量，并對該方法進行了評價。【本研究切入點】實時熒光定量PCR檢測技術是一種方便、快速、準確、用樣量小、非微生物培養的定量方法[12-14]，其檢測原理是在反應體系中加入熒光基團，在整個監測進程中利用熒光信號積累來反應體系變化，后通過生成標準曲線進行定量分析未知樣品的一種方法[15-20]。實時熒光定量PCR檢測技術同樣也可用于土壤真菌的定量檢測。研究新疆棉田根際土壤真菌熒光PCR技術定量及其時空動態。【擬解決的關鍵問題】研究采用實時熒光定量PCR技術，建立棉田根際土壤真菌定量分析的方法，對新疆主要棉花生態區棉花根際土壤進行調查，明確其根際土壤真菌分布規律及其與黃萎病病原菌數量的關系[17]。

1 材料與方法[18]

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

分別在棉花的4個生育期(苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期)對新疆北疆地區的石河子(SHZ)、烏蘇(WS)和精河(JH)；南疆地區的庫爾勒(KEL)、圖木舒克(TMSK)和阿拉爾(ALE)；東疆地區的哈密(HM) 7個植棉區進行土樣采集。以棉株根際10～15 cm深的土壤為采樣標準，分別標明為棉花病株還是棉花健株，采樣后用直徑為2 mm的篩網過篩、混勻后裝入密封袋中保存在4 ℃冰箱中，待測。

1.1.2 主要試劑

試劑：Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(生物工程股份有限公司)。

1.1.3 主要儀器

儀器：Eppendorf Centeifuge 5417R型離心機(美國默飛世爾科技公司)；DW-40L188型醫用低溫保存箱(杭州艾普儀器設備有限公司)；T Personal型PCR儀(杭州博日科技有限公司)；DYCP-31E型電泳儀(北京六一儀器廠)；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；Epoch型超微量微孔板分光光度計(濟南利科醫療器械有限公司)；Roche LightCyclerR480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀(羅氏醫學儀器公司)。

1.2 方 法[9]

1.2.1 棉花根際土壤微生物基因組總DNA的提取

利用土壤基因組DNA抽提試劑盒對棉花病株根際土壤和棉花健株根際土壤基因組總DNA進行提取。將提取的DNA樣品保存在-20℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR反應體系的優化

應用真菌通用性引物0817F (5'- TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')和1196R (5'- TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')對土壤基因組總DNA進行擴增，探針用 FAM 和 BHQ1，同時設不加模板的為陰性對照，每個反應重復3次。根據反應的Ct值、最佳退火溫度及擴增效率(接近100%)對擴增體系進行優化，進而得到熒光定量PCR的反應體系為：模板5 μL，引物各0.8 μL，FS Essential DNA Probes Master 10.0 μL，探針0.4 μL，總體系為20 μL，95℃預變性10 min；95℃變性25 s，50℃退火120s，72℃延伸90s，共進行45個循環。

1.2.3 重組質粒的制備與鑒定[19]

對最佳擴增條件下得到的PCR擴增產物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行純化，將純化的土壤真菌擴增物構建質粒后轉化到大腸桿菌感受態細胞中，通過藍白斑試驗篩選出陽性轉化菌。

1.2.4 標準曲線的建立

用質粒DNA小量抽提試劑盒提取上述陽性質粒DNA，再用超微量分光光度計測定質粒的OD值，進而計算質粒的濃度。把已獲得的質粒稀釋成不同濃度，用熒光定量檢測已稀釋的不同濃度質粒標準品，在Roche LightCycle 480軟件內拷貝數據，用Origin 8.5軟件作圖并生成方程，建立Ct值與棉花根際土壤真菌濃度之間的線性關系。

1.2.5 樣品的RT- qPCR檢測

在最優擴增條件下對不同地區和生育期的棉花根際土壤真菌DNA樣品進行PCR擴增，用RT-PCR對擴增后的根際土壤真菌進行定量檢測，將得到的每個樣品對應的Ct值帶入上述重組質粒DNA構建的標準曲線方程中，計算棉花在不同生長期及所對應地區的根際土壤真菌的含量(copies/g FRW)。

1.2.6 棉花黃萎病病原菌的RT-qPCR

構建棉花黃萎病病原菌RT-PCR反應體系的優化及質粒標準品，以及標準曲線和標準方程的建立。其中以棉花根部組織總DNA為模板，進行 RT-PCR 檢測，同時設無棉花黃萎病菌的空白對照，每個反應體系設3個重復。

1.2.7 棉花黃萎病病原菌與根際土壤真菌的相互關系

定量檢測7個采樣點棉花根部黃萎病病原菌和根際土壤真菌。用皮爾遜相關系數(Pearson correlation coefficient, PCC)分析黃萎病病原菌與根際土壤真菌的相關性，在SPSS 22軟件中進行PCC分析。

1.3 數據處理

研究用Origin 8.5和Excel軟件對數據作圖，SPSS 22軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制[20]

根據已知重組質粒全序列計算質粒標準品的拷貝數為8.92×105copies/g (FRW)，以10倍梯度稀釋標準品，獲得8.92×105～8.92×105copies/g (FRW) 6個稀釋梯度的標準品。將6個不同稀釋度的標準品進行實時熒光定量PCR檢測，將LightCyclerR480系統軟件得到的數據進行作圖。圖1,圖2

研究表明，曲線的相關性系數R2=0.993，說明標準品的濃度與循環數Ct之間的相關性較強；曲線的截距為30.797，斜率為-2.165 1。故棉花根際土壤真菌的DNA起始濃度對數值與Ct值之間的標準曲線方程為y=-2.165 1x+30.797，其中x為根際土壤真菌DNA起始濃度的對數值，y為擴增反應Ct值。圖2

圖1 10倍梯度稀釋陽性質粒的熒光定量PCR擴增曲線
Fig.1 Real-time PCR amplifacation curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

圖2 10倍梯度稀釋陽性質粒的熒光定量PCR標準曲線
Fig.2 RT-q PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 不同生育時期新疆棉花黃萎病病株根際土壤真菌數量

研究表明，在棉花四個生育期(苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期)，棉花病株根際土壤真菌數量最大值出現在吐絮期。庫爾勒棉花病株根際土壤真菌在苗期達到最大，為4.23×104copies/g FRW，苗期到蕾期直線下降，隨后變化趨勢不大；阿拉爾棉花病株根際土壤真菌在苗期至蕾期逐漸增加，隨后逐漸減小，在吐絮期達到最小，為1.41×10-4copies/g FRW；哈密棉花病株根際土壤真菌從苗期到花鈴期呈現先增大后減小的趨勢，花鈴期到吐絮期直線增長，吐絮期達到最大，為6.16×104copies/g FRW；精河棉花病株根際土壤真菌在苗期最小，石河子、烏蘇、精河和圖木舒克棉花病株根際土壤真菌在苗期到花鈴期變化趨勢不大，花鈴期到吐絮期逐漸增加。圖3

圖3 不同生育時期棉花黃萎病株根際土壤真菌數量變化
Fig.3 Variation of number of fungi in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different growth stages

2.3 新疆不同地區棉花黃萎病株根際土壤真菌數量

研究表明，總體來看新疆棉花病株根際土壤真菌數量的空間變化是東疆大于南疆大于北疆。石河子、烏蘇和精河在吐絮期棉花病株根際土壤真菌較多，首先是烏蘇，其次是精河，最后是石河子；庫爾勒棉花病株根際土壤真菌在苗期最多，為4.23×104copies/g FRW；圖木舒克和阿拉爾的棉花病株根際土壤真菌在整個生育期都表現較少，哈密棉花病株根際土壤真菌在吐絮期呈現最多，為6.16×104copies/g 。圖4

圖4 不同地區棉花黃萎病株根際土壤真菌數量變化
Fig.4 Variation of number of fungi number in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different regions

2.4 棉花根際土壤真菌與黃萎病菌數量的相互關系

采樣點石河子的花鈴期、阿拉爾的吐絮期其棉花根部病原菌分布較多，但根際土壤真菌分布較少，其他地區表現為棉花根部黃萎病病原菌分布較高的采樣區同時期其根際土壤真菌分布也較高。在所測的七個樣點中，苗期棉花黃萎病病原菌和根部土壤真菌的分布均較低。北疆棉花根部黃萎病病原菌分布的最大值較多出現在花鈴期，而南疆和東疆一般出現在棉花吐絮期。石河子、烏蘇均在花鈴期棉花黃萎病病原菌分布最高，但在吐絮期根際土壤真菌分布最高。采樣點阿拉爾的棉花根際土壤真菌數量分布在整個生育期的吐絮期為較小，而同期黃萎病病原菌數量分布最高。表1

研究表明，北疆精河和東疆哈密棉花根際土壤真菌數量與黃萎病病原菌數量的PCC分別高達0.989和0.993，呈顯著正相關。而南疆圖木舒克棉花根際土壤真菌數量與黃萎病病原菌數量的PCC為0.880，呈正相關。北疆石河子和烏蘇、南疆庫爾勒和阿拉爾棉花根際土壤真菌與黃萎病病原菌的PCC分別為-0.252 和-0.305、-0.539和-0.777，均呈負相關。表2

表1 棉花不同地區和生育期根部所帶黃萎病病原菌數量及根際土壤真菌含量
Table 1 Number of pathogens of Verticillium wilt and rhizosphere soil fungi in roots of cotton in different regions and periods (copies/g FRW)

Sampling sites苗期Seeding stage蕾期Bud stage花鈴期Flower stage吐絮期Boll opening stage病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungusSHZ118388.025 11771 186.645131 0060.372 60921 7109 983.443WS42.102 277249 451759.508 3131 200137.637 358 0882 0437.36JH46.60E-0514 302609.216 423 376301.179 228 52716 550.69KEL942 258.66515.25 144.1762 4025 361.2781 1145 244.056ALE4732 175.9338 7584 378.19333 1271 836.5775 767 6150.000 141TMS871 578.373806.92 254.67283 470298.614 3853 0605 141.67HM2323 142.353699.67 123.0341 8273 960.062483 46261 603.6

表2 不同采樣點棉花根際土壤真菌與棉花黃萎病原菌數量的PCC
Table 2 PCC of the number of fungi and cottonVerticilliumwiltin the rhizosphere soil of cotton at different sampling points

Sampling locationsSHZWSJHKELALETMSHMPCC-0.252-0.3050.989*-0.539-0.7770.8800.993*

研究表明，各生育時期棉花根際土壤真菌數量與黃萎病病原菌數量均呈負相關。其中花鈴期棉花內生真菌與黃萎病病原菌的 PCC為-0.620，其相關度較高。其他根際土壤真菌與黃萎病病原菌之間相關性均較低，如苗期棉花根際土壤真菌與黃萎病病原菌的 PCC 僅為-0.153。表3

表3 棉花不同生育期根際土壤真菌與棉花黃萎病原菌數量的PCC
Table 3 PCC of rhizosphere soil fungi and cottonVerticilliumwiltpathogens in different growth stages of cotton

Growth stagesSeedling stageBud stageFlower seasonBoll opening stagePCC-0.153-0.401-0.620-0.327

3 討 論

目前，對于我國棉花內生真菌的研究還處于起步階段，可見的報道也很少，我國棉花根際土壤真菌的報道更是少之又少。土壤作為棉花黃萎病土傳災害的來源，探究其與棉花黃萎病的關系是很重要的。2010 年，Tellenbach等[21]建立了植物內生真菌的方法。史應武等[17]建立了有關新疆棉花內生真菌的實時熒光定量PCR檢測報道，張濤等[18]建立了有關新疆棉花根際土壤細菌實時熒光定量PCR的檢測報道，李雪艷等[22]建立了有關新疆棉花內生細菌實時熒光定量PCR的檢測報道，實驗借鑒他們的方法開展新疆棉花根際土壤真菌的實時熒光定量PCR檢測。除此之外，我國尚未報道過實時熒光定量PCR 技術檢測棉花根際土壤真菌的研究。

4 結 論

新疆棉花病株根際土壤真菌數量在時間和空間上變化不盡相同，數量在空間變化上是東疆大于南疆大于北疆；數量在時間變化上是吐絮期最大，花期最小。但具體的變化趨勢仍然不明朗，有待更系統全面的研究；且在不同的植棉區棉花病株根際土壤真菌的差異很大，這也說明了不同植棉區的土壤環境差異很大，該文只是初步探討了新疆棉花黃萎病株根際土壤真菌的變化趨勢，有關不同土壤環境對真菌的適應性還有待進一步的研究。

新疆棉花根際土壤真菌數量與黃萎病病原菌數量有一定的相關性，但總體上這種相關性在棉花不同生態區及其各個生育期并沒有表現出明顯的規律性，只是說明兩者在棉花不同生態區表現為正相關，而在不同生育期則表現為負相關。在棉花不同生育期，根際土壤真菌數量與黃萎病病原菌數量呈較高的負相關性可能是因為隨著棉花生育時期的推進，黃萎病病原菌在棉花根部大量繁殖，對棉花根際土壤的營養條件造成很大破壞，同時形成空間及營養競爭，導致根際土壤真菌不能很好的生長和繁殖。