建立矮膜苞芹HPLC指紋圖譜

胡江蘭，朱金芳,2，帕爾哈提·多力坤

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】矮膜苞芹(HymenoleanananaRupr.)，又名膜苞棱子芹、天山棱子芹，俗名庫魯木提，為傘形科(Umbelliferae)棱子芹屬(Pleurospermum)高山膜苞芹亞屬(HymenoleanaDC)多年生草本植物[1，2]。主要分布于中國新疆塔什庫爾干、和田及天山地區，中亞也有分布[3，4]。矮膜苞芹富含多種對人體有益的成分，防治高血壓[5]、糖尿病[6]、冠心病、腦血栓等疾病。研究其指紋圖譜，對進一步開發利用矮膜苞芹藥材資源有實際意義。【前人研究進展】中藥指紋圖譜因其能夠全面直觀的反應中藥材活性成分的種類及數量，宏觀、系統的反應中藥材的內在質量，目前是國際公認的控制中藥材質量有效手段。近年來，研究發現矮膜苞芹含有黃酮、揮發油、甾體、強心苷、三萜類、皂苷、酚類、糖類、香豆素等成分[7]。【本研究切入點】矮膜苞芹為生長在海拔4 000 m以上的珍稀藥材，目前關于矮膜苞芹研究的相關文獻較少，對于其指紋圖譜的研究在國內尚未見報道。指紋圖譜的建立對藥材人工繁育、篩選優良種質資源、全面控制藥材質量顯得尤為重要。目前，尚未見其指紋圖譜方面的研究報道。研究建立矮膜苞芹HPLC指紋圖譜。【擬解決的關鍵問題】采用高效液相色譜法(HPLC)，通過梯度洗脫，研究10批藥材的HPLC圖，運用2012.1A版中藥色譜指紋相似度評價系統軟件分析相似度、SPSS19.0軟件進行聚類分析及SIMCA14.0軟件進行主成分(PCA)與偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA),建立矮膜苞芹的HPLC指紋圖譜，為矮膜苞芹藥材的全面質量控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材料

木犀草素(批號：130610，購于上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度≥98%)、黃芩苷(批號：21967，購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥ 98%)，乙腈為色譜純，甲酸、甲醇均為分析純，水為純凈水。矮膜苞芹(采自新疆塔什庫爾干塔吉克自治縣)經新疆醫科大學中醫學院盛萍教授鑒定為傘形科植物矮膜苞芹的干燥地上部分。10批藥材均為生長在高原高寒干旱-半干旱氣候的塔什庫爾干野生品種，采集時間分別為S1(20150922)，S2(20160730)，S3(20170325)，S4(20170622)，S5(20171110)，S6(20180312)，S7(20180405)，S8(20180512)，S9(20180809)，S10(20180824)，其中S3(20170325)和S4(20170622)采自慕士塔格峰，海拔為6 000 m，其他批次均采自塔什庫爾干塔吉克自治縣，海拔為4 500 m。

1.1.2 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；AL 104型精密電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；TG16-W微量高速離心機；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器廠)。

1.1.3 色譜條件

采用WondaCract ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈(A): 0.1%甲酸水(B)梯度洗脫(0～30 min，15%～30% A；30～45 min，30%～70% A；45～55 min，70% A；55～65 min，70%～15% A)；流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長283 nm，進樣量10 μL。

1.2 方 法

1.2.1 供試品溶液制備

取矮膜苞芹藥材粉末約1 g，精密稱定，加入20 mL甲醇稱定重量，于70℃加熱回流2 h，用甲醇補足損失的重量，濾過，取續濾液，即得。

1.2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取各對照品適量，分別置于不同的5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，作為對照品貯備液，于4℃冰箱保存備用。

1.2.3 精密度試驗

取S1藥材粉末，按1.2.1方法制備供試品溶液，在其色譜條件下連續測定6次，共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<1.8%，儀器精密度良好。

1.2.4 穩定性試驗

取S1藥材粉末，按1.2.1方法制備供試品溶液，分別在溶液制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣測定。共有峰相對保留時間RSD< 0.9%，相對峰面積RSD< 2.0%，供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

1.2.5 重復性試驗

取S1藥材粉末6份，分別按1.2.1方法制備供試品溶液，在其色譜條件下分別進樣分析。共有峰相對保留時間RSD< 1.0%，相對峰面積RSD< 1.8% ，該方法重復性好。

1.3 數據處理

應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012.1A)分析和繪制HPLC指紋圖譜，運用SPSS19.0和SIMCA14.0進行聚類分析、主成分分析和偏最小二乘法-判別分析指紋圖譜相關數據。

圖1 10批矮膜苞芹藥材的HPLC指紋譜
Fig.1 HPLC fingerprint of 10 batches ofHymenoleananana

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜采集

取10批矮膜苞芹藥材，分別按1.2.1方法制備供試品溶液，按1.1.3色譜條件進樣檢測，得到各批次矮膜苞芹藥材的HPLC圖譜，以新采集的藥材(S10)的指紋圖譜為參照圖譜，采用平均數相關系數法對各指紋圖譜色譜峰進行多點校正和自動匹配，生成對照指紋圖譜R，并建立10批矮膜苞芹藥材的指紋圖譜。圖1

2.2 共有峰標定

根據10批藥材指紋圖譜的檢測結果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統的數據匹配功能，在對照指紋圖譜上標定出共有色譜峰13個。經與對照品比對，確定5號峰和7號峰分別為黃芩苷和木犀草素。其中2號峰最高，且對稱性和分離度均較好，故選擇其作為參照峰(S)，分別計算其他共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。表1 ,表2

注：5.黃芩苷；7.木犀草素

Note: 5.Baicalin; 7.Luteolin

圖2 矮膜苞芹藥材對照特征譜(A)及混合對照品的特征譜(B)
Fig.2 Control characteristic chromatogram ofHymenoleananana(A) and characteristic chromatogram of mixed reference (B)表1 10批矮膜苞芹指紋圖譜共有峰相對保留時間
Table 1 10 batches ofHymenoleanananafingerprint shared peak relative retention time

樣品編號Sample number峰1Peak 1峰3Peak 3峰4Peak4峰5Peak 5峰6Peak6峰7Peak7峰8Peak 8峰9Peak 9峰10Peak 10峰11Peak 12峰12Peak 12峰13Peak 13S10.4071.1851.2851.4651.8401.8622.1532.3302.3992.4252.4692.526S20.4081.1851.2821.4671.8351.8532.1452.3202.3892.4152.4592.515S30.4081.1851.2841.4681.8371.8572.1482.3242.3932.4192.4642.520S40.4061.1861.2831.4691.8381.8562.1482.3232.3922.4182.4622.519S50.4091.1871.2841.4671.8371.8542.1472.3232.3922.4182.4622.519S60.4061.1841.2821.4651.8361.8562.1462.3222.3912.4172.4612.518S70.4061.1831.2821.4651.8371.8592.1492.3262.3942.4202.4652.521S80.4051.1831.2831.4651.8381.8592.1502.3262.3952.4212.4652.522S90.4061.1871.2861.4731.8431.8652.1562.3342.4022.4292.4732.529S100.4101.1881.2841.4721.8401.8582.1502.3262.3952.4212.4662.522

注：2號峰(S)均為1.000，表3同

Note: Peak 2 (S) is 1.000, the same as Table 3

表2 10批矮膜苞芹指紋圖譜共有峰相對峰面積
Table 2 The relative peak area of the common peaks of 10 batches ofHymenoleananana

樣品編號Sample number峰1Peak 1峰3Peak 3峰4Peak4峰5Peak 5峰6Peak6峰7Peak7峰8Peak 8峰9Peak 9峰10Peak 10峰11Peak 12峰12Peak 12峰13Peak 13S10.2290.1780.3690.0110.3660.0030.0860.0610.0170.0360.0270.080S20.2250.1910.3950.0220.1530.0170.1070.0720.0160.0400.0250.093S30.3230.1840.4030.0200.3230.0030.0770.0540.0140.0320.0240.071S40.1780.1650.1920.0200.4410.0050.2340.1530.0330.0960.0450.304S50.1990.1590.2710.0220.4110.0030.1230.0860.0260.0610.0370.134S60.2460.1680.4150.0250.2300.0440.4940.3500.0780.2250.0610.665S70.1980.1140.3430.0400.4400.0630.5510.3350.0560.1890.0690.802S80.1140.1190.2340.0480.5300.0540.6940.4170.0850.2490.0931.051S90.8370.2950.4670.0130.0270.0030.1500.1340.0480.2550.0160.237S100.8250.3030.4380.0170.0220.0020.1380.1180.0460.2300.0150.205

2.3 相似度評價

研究表明，相似度分析結果大致可以分為三類，第1類為S8，其相似度< 0.8；第2類為S6、S7，其相似度在0.8 ～ 0.9；第3類為S1、S2、S3、S4、S5、S9、S10，其相似度均>0.9。相似度結果表明,10批矮膜苞芹藥材成分相似度較高，但S8的相似度較差。不同批次矮膜苞芹所含化學成分存在不同程度的差異，綜合指紋圖譜中各批次藥材主要峰群，其峰形基本一致，只是成分含量略有不同。各批藥材間相似度差異可能受采收時間、海拔、樣品本身差異等多種因素影響。表3

表3 10批矮膜苞芹相似度評價
Table 3 Evaluation of similarity of 10 batches ofHymenoleananana

樣品編號Sample numberS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10RS110.9980.9970.9240.9790.790.7670.6960.8650.8660.965S20.99810.9930.9330.9850.7920.7710.7060.8390.8410.955S30.9970.99310.9160.9730.7830.7580.6830.870.8770.965S40.9240.9330.91610.9650.8650.8830.8490.7950.7960.934S50.9790.9850.9730.96510.8090.8060.7550.8220.8280.953S60.790.7920.7830.8650.80910.9750.9480.7490.740.857S70.7670.7710.7580.8830.8060.97510.9770.6920.6820.828S80.6960.7060.6830.8490.7550.9480.97710.6270.6160.769S90.8650.8390.870.7950.8220.7490.6920.62710.9910.948S100.8660.8410.8770.7960.8280.740.6820.6160.99110.949R0.9650.9550.9650.9340.9530.8570.8280.7690.9480.9491

2.4 藥材指紋圖譜聚類

研究表明，10批樣品在距離25時被聚為1類。距離20 ～ 5時，聚為2類，其中S9、S10與其他批次分隔開，表明這兩個批次差異性較大。距離5 ～ 0時，藥材被依次分開。最終聚為3類，即S1、S2、S3、S4、S5聚為一類，S6、S7、S8聚為一類，S9、S10聚為一類。從藥材來源分析，S1、S2、S3、S4和S5采集時間最早，儲存時間最長；S9、S10為最近采集，儲存時間最短；而S6、S7、S8采集時間較早，儲存時間相對較長，矮膜苞芹藥材質量可能受采收時間、儲存條件等影響，需進一步研究。圖3

圖3 10批矮膜苞芹藥材聚類分析樹狀圖
Fig.3 10 batch ofHymenoleanananasquid cluster analysis tree diagram relationship

2.5 藥材指紋圖譜PCA及PLS-DA分析

研究表明，前2個主成分的特征值均大于1，說明前2個因子在藥材共有成分的相互關系中起主導作用。其中，第一主成分方差貢獻率為 64.95%；第二主成分方差貢獻率為17.28%，累計方差貢獻率為82.23%。表明前2個主成分能夠客觀得反映10批矮膜苞芹指紋圖譜的信息，PCA得分分布。表明S9和S10與其他批次明顯區分，但其他批次間無明顯區分。PLS-DA模型的主成分回歸系數Q2Y=0.598>0.5，說明模型的預測能力較強；R2Y=0.851 9，即模型對因變量變異貢獻的百分比為85.19%，說明模型擬合度較好。PLS-DA分析結果，表明10批藥材被明顯區分為三類，即S1、S2、S3、S4、S5為一類，S6、S7、S8為一類，S9、S10為一類，與藥材聚類分析結果吻合。圖4,圖5

圖4 PCA得分分布
Fig.4 Score plot of PCA

圖5 PLS-DA得分分布
Fig.5 Score plot of PLS-DA

提取PLS-DA模型中13個變量的重要性投影(VIP)值，研究表明,對13個共有峰面積VIP值大小進行排列，VIP值越大說明該共有峰對分類的貢獻越大[8]。選擇VIP值大于1的共有峰，結果顯示，峰2(VIP值：1.829)，峰1(VIP值：1.487)，峰13(VIP值：1.308)，峰6(VIP值：1.194)和峰4(VIP值：1.111)VIP值均大于1，說明以上化學成分對不同批次矮膜苞芹藥材分類具有顯著影響，這些成分是引起不同批次藥材差異的主要標志性成分。其余色譜峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小。圖6

圖6 各共有峰對藥材分組VIP值
Fig.6 VIP value of each common peak grouped with herbs

3 討 論

3.1 色譜條件選擇

由于矮膜苞芹藥材成分較為復雜，研究了甲醇-0.05%甲酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等溶劑系統進行梯度洗脫[9-11]，篩選最佳流動相；并對進樣量5、10、20 μL進行了考察；應用二極管陣列檢測器同時比較了254、283、340、350 nm不同波長下的色譜圖信息[12-14]，結果表明，以乙腈:0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，進樣量為10 μL，在283 nm波長下，色譜圖的色譜峰較多，分離度較好，各色譜峰對稱性及拖尾因子均符合要求。

3.2 建立質量標準及其指紋圖譜

建立的矮膜苞芹HPLC指紋圖譜方法精密度、穩定性、重復性好。將指紋圖譜數據與相似度評價、聚類分析及主成分分析相結合，結果表明不同批次的矮膜苞芹HPLC指紋圖譜既有共性又有差異。各批次藥材的色譜峰整體圖譜相似，但峰面積又有所差異，表明不同因素對藥材成分的含量有影響。研究表明，中藥材主要活性成分含量測定，因其地域、品系、采樣時期、加工方式、貯存時間等因素均會對試驗結果有影響[15]。因此，各批次色譜峰峰面積有所差異分析可能原因是因氣候、海拔、采收時間、儲存時間、樣品本身差異、采收方式等不同所導致。

4 結 論

建立了矮膜苞芹藥材的HPLC指紋圖譜，確定了13個共有峰。通過精密度、穩定性、重復性試驗證明，該方法符合建立指紋圖譜各項要求。運用相似度評價對建立的指紋圖譜進行分析，發現不同批次藥材質量相似性較好，采用聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法-判別分析彌補了單純應用相似度評價指紋圖譜的不足，能夠反映藥材多成分的特點，整體控制矮膜苞芹藥材的質量。