不同油菜品種對鹽堿土壤理化性質與微生物多樣性的影響

劉東洋，徐接亮，張鳳華

(1.石河子大學農學院， 新疆石河子 832003； 2.石河子大學綠洲生態農業重點實驗室， 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】中國鹽堿地面積較大，目前鹽堿地總面積約達3 600×104hm2，占全國可利用土地面積的4.88%[1]，新疆是中國最大的鹽堿地地區。相關研究顯示,新疆鹽堿土面積占耕地面積30.12%[2]，并且受地理環境、人為因素的限制，例如氣候、化肥不合理的施用等多方面的影響，新疆土壤次生鹽漬化程度仍在持續加重，鹽堿地面積不斷擴增，如何有效開發利用鹽堿地已經成為迫切要需要解決的問題。傳統的鹽堿地改良方法有物理改良措施、化學改良措施、生物改良措施等方法，其中生物改良措施具有成本低、經濟效益高等諸多優點。鹽堿地種植油菜屬于生物改良措施，油菜有一定的耐鹽能力，其在鹽堿地上有著良好的生長表現[3-4]，而在新疆鹽堿地地區還尚未有鹽堿地種植油菜的報道。通過16S-rRNA高通量測序技術,對于新疆鹽堿地區種植油菜具有一定指導意義。【前人研究進展】鹽堿土會致使土壤肥力下降，植株根系吸水困難，進而影響作物生長，是限制農業發展的關鍵性因素之一，研究表明,鹽堿地種植作物進行生物改良[5-6]，不僅能夠降低土壤鹽分、提高土地生產力，而且能有效改善土壤生態環境[7-8]。油菜作為世界主要油料作物[9]，不僅在食用、工業能源等領域備受矚目，其也是少數用于開發利用鹽堿地的作物之一，李國林等[10]研究表明種植油菜可以利用其莖葉覆蓋地面，延長了土地綠色覆蓋時間，有效抑制了鹽堿土壤返鹽特點；梅勇[11]研究表明,種植耐鹽油菜對于中度重度鹽堿地土壤理化性質有一定的改善作用；張培通等[12]研究表明在含鹽量0.2%～0.4%的鹽堿地上油菜能夠良好的生長。【本研究切入點】新疆鹽堿化嚴重，目前有關新疆鹽堿地種植油菜鮮有報道。選取不同油菜品種，研究不同油菜品種間土壤理化性質及微生物多樣性的變化?！緮M解決的關鍵問題】篩選出更適宜鹽堿地生長的油菜品種，為新疆鹽堿地開發利用提供理論基礎，為鹽堿地大面積種植油菜提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗地設在新疆石河子墾區石總場四分場，屬于高緯度的典型溫帶大陸性氣候，冬季長而嚴寒，夏季短而酷熱，光照充足，雨量稀少，氣候干燥，年平均氣溫6.6℃，年降水量平均180 mm，蒸發量1 600 mm，年平均日照時數2 784 h，無霜期年平均166 d，≥0℃積溫3 918℃。

油菜品種為 1、16-22外、華5號、金油158均為甘藍型油菜，由華中農業大學提供。土壤樣品于油菜收獲期進行采集。采取五點取樣法，取油菜0～20 cm的耕層土壤，剔除土壤表面雜質將土壤樣品保存封口塑料袋中，置于冰袋中冷藏迅速帶回實驗室，然后將土壤樣品分為兩份，一份土壤樣品在-80℃在保存，各品種油菜土壤編號分別為1、16-P22外、華5號、金油158，供土壤微生物多樣性分析。另一份土壤樣品風干后通過2 mm篩用于土壤理化性質的分析。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

試驗于2017年7月16日進行，采取單因素隨機區組設計，試驗設計4個處理：1、16-P22外、華5號、金油158，三次重復。小區長5.2 m，寬2.1 m，每個小區播7行，行距30 cm，小區播量15 g左右，播種方式為人工撒播。

1.2.2 土壤理化性質

土壤pH測定采用酸度計法(水土比為5∶1)；土壤電導率利用電導儀測定(水土比為2.51)；土壤堿解氮采用堿解擴散法；土壤速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀采用NH4Ac浸提-火焰光度法測定，土壤有機質測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法進行測定[13]。

1.2.3 土壤DNA的提取、PCR擴增

土壤總DNA使用美國MP Biomedicals公司的FastDNATMSpin試劑盒，每個樣品稱重0.5 g土壤，按照試劑盒說明和參考文獻方法進行DNA的提取[14]。提取的土壤總DNA濃度和純度用分光光度計(NanoDrop 2000)檢測。采用文獻的方法利用細菌16S rRNA通用引物對測序區域515F-907R(V4-V5區)進行PCR擴增，引物序列為F：515F：(5＇-GTGCCAGGMGCCGCCG-3＇)和R：907R：(5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇)[15]。PCR正式試驗采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系。PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環數為27個；72℃ 10 min(GeneAmpR9700, ABI,USA)。

1.2.4 測序

樣品經純化檢測后送往中國上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina MiSeq PE300測序平臺進行測序。

原始QASQ文件運用QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology,version 1.9.1)進行序列過濾。序列過濾的標準：(1)過濾Q<20的堿基，過濾50 bp以下的reads ；(2)將成對reads拼接成一條序列，最小overlap 長度為10 bp ，且overlap 區允許的最大錯配比率為0.2；(3)檢測序列末端barcode 2序列，最小錯配數為0，將起始段包含barcode 2的序列進行反向互補并去除barcode 2；(4) 檢測序列上barcode 1并區分樣品，barcode 1錯配數為0，最大引物錯配數為2。

1.3 數據處理

通過使用Userch(version 7.1)軟件平臺對優質序列按相似水平0.97進行OTU聚類，使用UCHIME識別和去除嵌合序列[16]。在QIIME中使用RDP Classifier(version 2.2)對比16S rRNA數據庫Silva(Release123)進行分析，置信度閾值為0.7。

根據OTU列表中各個土壤樣品物種豐富度情況，應用Mothur軟件[17](version v.1.30.1)計算菌群豐富度指數Chao1指數、ACE指數和菌群多樣性指數Shannon指數、Simpson指數、Coverage指數。 Venn圖可用于統計多個樣本中共有和獨有的OTU數，使用R語言工具統計，分析時選用相似水平為97%的OTU[18]。稀釋曲線利用mothur做rarefaction分析，利用R軟件制作稀釋性曲線圖。主成分分析PCA和相關性Heatmap圖由R語言(version 3.42)軟件生成。

基于97%相似度的OTU分類學水平，采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與所能代表的OTU數目構建稀釋性曲線。使用97%相似度的OTU，利用mothur計算不同隨機抽樣下各個樣品的豐富度和多樣性指數。以OTU的物種分類結果為依據，利用QIME軟件對4組油菜土壤樣品在門和屬的分類級別上對細菌的組成和結構以及相對豐度進行分析。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

研究表明，不同品種油菜間土壤理化性質呈現差異性，土壤pH值、電導率、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質因種植油菜品種的不同而發生相應的改變(P<0.05)。1樣品pH值顯著高于16-P22外樣品，且1與16-P22外均與華5號和金油158樣品無顯著性差異；1和華5號樣品電導率顯著高于16-P22外和金油158樣品，且16-P22外與華5號樣品間無顯著性差異；堿解氮16-P22外樣品與華5號和金油158樣品無顯著性差異，但均顯著高于1樣品；16-P22外、華5號和金油158樣品的速效磷和有機質含量均顯著高于1樣品，含量平均高61%和18.75%。1樣品和金油158樣品速效鉀含量均顯著高于16-P22外和華5號樣品，且華5號樣品速效鉀含量最低。表1

表1 不同油菜品種土壤樣品基本理化性質
Table 1 Basic physicochemical properties of different rapeseed soil samples

樣品pH電導率堿解氮速效磷速效鉀有機質SampleEC(us/cm)AN(mg/kg)AP(mg/kg)AK(mg/kg)SOM(g/kg)1 8.42a699.67a57.13b47.77b639.28a24.43b16-P22外8.26b559.67c64.13a78.43a600.85b 29.60a華5號8.31ab686.33b62.97ab74.19a559.49c28.82a金油1588.35ab558c62.38ab78.11a621.1a28.61a

注：同列不同小寫字母表示樣品間差異達顯著水平(P<0.05)，下同

Note：Different letters within the same column mean significant difference among samples at 0.05 level.The same as below

2.2 OTU聚類

對4組油菜土壤樣品進行16S rRNA基因序列分析，得到最終用于后續分析的優化序列178 320條，按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，統計油菜土樣的豐度信息得到OTU的代表序列6 468條。1、16-P22外、華5號、金油1 584組樣品中包含的OTU數目分別為1 602、1 615、1 591、1 660。其中，金油158樣品的OTU數目最多為1 660，華5號樣品的OTU數目最少為1 591。4個樣品共同包含的OTU數為1 083個，將4個樣品進行兩兩比較發現，其中1與16-P22外共有的OTU為1 304個，1與華5號共有的OTU為1 287個，1與金油158共有的OTU為1 328，16-P22外與華5號共有的OTU為1 309個，16-P22外與金油158共有的OTU為1 351個，華5號與金油158共有的OTU為1 344個。而1、16-P22外、華5號、金油158中特有的OTU分別為100、82、76、90，1中特有的OTU數目最多，可能含有較多的特殊微生物種類。表2,圖1

2.3 16S rRNA基因測序深度

研究表明,4個樣品的稀釋性曲線基本上已經趨于平緩，說明測序數據量基本合理，能夠比較真實的反映這4個樣品中的微生物群落，4組樣品已經獲得了絕大多數的樣本信息，基本能夠反映這4組土壤樣品中微生物群落組成。圖2

圖1 OTU分布維恩
Fig.1 Venn diagram showing the distribution of OTUs

圖2 OTU稀釋曲線
Fig.2 Rarefaction curves of OTU

2.4 微生物多樣性指數

研究表明，各品種油菜土壤樣品Chaol和ACE指數間無顯著性差異，且大小順序為金油158>16-P22外>1>華5號，不同油菜品種土壤樣品中金油158微生物群落豐富度最高，而華5號微生物群落豐富度最低， OTU聚類分析的結果也體現了這一結果的準確性。依據Shannon指數大小，將不同品種油菜土壤細菌群落多樣性程度由高到低排列，依次為1、華5號、16-P22外、金油158，16-P22外和華5號間無顯著性差異，均與1和金油158差異性顯著；依據Simpson指數大小，不同品種油菜土壤細菌群落多樣性程度由高到低排列，依次為1、16-P22外、華5號、金油158，其中16-P22外和華5號間無顯著性差異，兩者均與樣本1和金油158有顯著性差異。油菜品種1土壤樣品Shannon指數最高，Simpson指數最低，說明其土壤細菌群落多樣性最豐富；而油菜品種金油158土壤樣品Shannon指數最低，Simpson指數最高，其土壤細菌群落多樣性最少。表2

表2 樣品Miseq測序結果及微生物多樣性指數
Table 2 MiSeq sequencing results and the richness diversity indices for each sample

樣品Sanmpie序列數ChaolACEShannonSimpsonCoverage1 48 6381 930±171a1 935±136a5.89±0.04a0.007 9±0.00c0.986 7 16-P22外45 8301 982±192a1 953±137a5.82±0.04b0.008 9±0.00b0.988 0 華5號39 4371 863±149a1 869±118a5.84±0.04b0.009 2±0.00b0.987 8 金油15844 4151 988±168a2 001±136a5.77±0.04 c0.011 3±0.00 a0.986 7

2.5 微生物群落結構

在門的分類水平上，相對豐度大于1%的門共覆蓋了10個門，另外兩個菌群，一個由于分類譜系低于置信閥值，沒有得到分類信息，在統計學上被命名為“未分類”群，另一個被命名為“其他”群。研究表明，在所有4組土壤樣品中，變形菌門(Proteobacteria)是含量最豐富的門，在1、16-P22外、華5號、金油158 4組樣品中相對豐度分別為25.03%、24.27%、25.48%、24.86%，其次是放線菌門(Actinobacteria)，相對豐度分別為24.11%、23.32%、23.21%、18.62%，酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度分別為11.98%、12.10%、11.77%、12.76%，綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度分別為11.24%、9.07%、8.75%、8.45%。其余的菌門則占有較少的比例，比如硝化螺菌門(NitrosPirae)、藍藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonodates)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、“未分類”群和“其他”群。這個結果表明，在這4組樣品土壤的菌類結構中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)是優勢類群，而剩余的細菌類群則為非優勢類群。圖3

圖3 樣品中門水平細菌群落結構及分布
Fig.3 Bacterial community structure and distribution of the samples at phyla

研究表明，共覆蓋了34個屬,其中24個屬為未分類和未命名菌屬，未知菌群(others)在各組樣品中所占比例最高，分別占4組油菜土壤樣品37.98%、6.02%、36.02%和35.64%。其中油菜土樣1中優勢菌屬為Acidobacteria_norank(9.08%)、Euzebyaceae_norank(7.31%)、MSB-1E8_norank(7.83%)，16-P22外優勢菌屬為Acidobacteria_norank(9.37%)、Euzebyaceae_norank(7.77%)、MSB-1E8_norank(6.48%)，華5號優勢菌屬為Acidobacteria_norank(9.42%)、Euzebyaceae_norank(7.52%)、MSB-1E8_norank(7.34%)，金油158優勢菌屬為Acidobacteria_norank(10.37%)、Euzebyaceae_norank(6.31%)、MSB-1E8_norank(6.74%)。相對豐度大于1%的未知菌群主要屬于未命名亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae_norank)、未命名Elev-16S-1332_norank、未命名放線菌綱(Actinobacteria_norank)、未命名芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes_norank)、未分類放線菌綱(Actinobacteria_unclassfied)、MSB-1E8_norank、未命名尤澤比氏菌科(Euzebyaceae_norank)、未命名酸桿菌綱(Acidobacteria_norank)的菌群。其中4組油菜土壤樣品中共有的Pontibacter屬為耐鹽性菌屬，其相對豐度分別占1、16-P22外、華5號、金油158 4組油菜土壤樣品中0.94%、1.67%、0.49%、0.72%，相對豐度大小順序為16-P22外>1 >金油158>華5號。圖4

圖4 樣品中屬水平細菌群落結構及分布
Fig.4 Bacterial community structure and distribution of the samples at Species

2.6 樣本間差異

研究表明，對4組土壤樣品OTU進行主成分分析(PCA)，共提取3個主成分，第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)分別可以解釋各維度的77.14%、14.94%，所以第1和第2主成分基本可以解釋主要結果。16-P22外與華5號構成的微生物群落相似性最高，與1和華5號差異明顯。圖5

注：樣本微生物群落組成越相似，PCA距離越近

Note ： The more similar the sample microbial community composition, the closer the PCA distance

圖5 基于OTU單元的主成分(PCA)
Fig.5 Principal component analysis based on OUT level

注：EC：電導率；AN：堿解氮；AK：速效鉀；AP：速效磷；SOM：有機質。(P<0.01)用**表示

Note：EC: electrical conductivity ;AN: available nitrogen ;AK: available potassium ;AP:available phosphorus ;SOM:(P<0.01) expressed by **

圖6 Spearman系數門水平細菌豐度前10與土壤理化性質的相關性
Fig.6 Correlation between on Spearman’s rank correlations of the 10 dominant bacterial phyla and soil physicochemical properties

2.7 土壤理化性質與微生物群落之間的關系

研究表明，各樣本土壤堿解氮含量、速效磷含量與浮霉菌門呈正相關(P<0.01)。土壤中堿解氮含量、速效磷含量與厚壁菌門呈負相關(P>0.01)。圖6

3 討 論

3.1 不同油菜品種間土壤理化性質的變化

張旭龍等[19]研究發現種植不同油葵品種均能降低鹽堿地pH值，顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀的含量。研究中在鹽堿地上種植不同品種油菜可以降低土壤pH，提高土壤肥力，其他研究者的結果驗證了這一點[10,20-21]，種植油菜對土壤有一定的改良效果，其中1對土壤速效磷含量提升最為顯著， 16-P22外顯著提高鹽堿土壤速效磷、堿解氮和有機質的含量，這說明不同油菜品種對鹽堿土壤理化性質要求不同，由于油菜根系具有活化固定氮、磷、鉀功能[22]，因此,不同油菜品種根系分泌物可以影響土壤理化性質，使得土壤適合該品種的生長，進而導致了不同油菜品種土壤理化性質之間的差異。同時楊瑞吉[23-24]研究表明種植油菜可以提高土壤肥力水平，梅勇[25]研究發現在半干旱區的鹽堿土壤上種植油菜也可以改善鹽堿土壤的理化性質。

3.2 土壤微生物群落菌群結構及多樣性

研究利用16S rRNA高通量測序技術對新疆石河子鹽堿地種植油菜后的土壤樣品進行測序分析。4組油菜土壤樣品得到了最終用于后續分析的優化序列178 320條，用于物種分類的OTU 2 184條，共覆蓋了30個門，68個綱、156個目、295個科、537個屬。稀釋曲線趨于平坦，說明獲得了絕大多數的樣本信息，基本能夠反映這4個土壤樣品中微生物群落組成。不同樣品的微生物多樣性指數(Ace 指數、Chao 指數、Shannon、Simpson 多樣性指數))的變化也與OTU聚類分析表現一致。

土壤類型和植被覆蓋類型對于微生物群落也有很大影響[26]。Zhibo等[27]研究西北地區復墾年限對于土壤細菌組成和多樣性的影響中共獲得了1 122 101條序列，被歸為12個門，占優勢的菌門包括變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和浮霉菌門。馬飛等[28]研究錦雞兒植物對于鹽堿地影響中發現變形菌門等十種菌群，其中包括并不常見的廣古菌門。這些微生物菌門絕大部分同樣存在于研究中，說明相似的鹽堿地環境下微生物群落的分布具有一致性。Ma B、Cheema S等研究[29-30]表明變形菌門為鹽堿環境下最為常見的菌門，這在研究中的結果一致。目前大約有50個細菌屬含有嗜鹽和耐鹽細菌，它們分別屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門[31]，其中Nitrospira屬相對豐度大小為16-P22外>華5號>金油158> 1。薩如拉等[32]研究玉米秸稈還田對鹽堿地土壤細菌多樣性的影響中發現了Pontibacter屬，此菌屬具有耐鹽特性[33]，而在研究中，Pontibacter屬4個油菜品種樣品相對豐度大小依次為16-P22外>1 >金油158>華5號，油菜品種16-P22外其根系相較于其它品種對于耐鹽細菌的促生有一定作用，更適宜于生長在鹽堿地環境中。鄭賀云等[34]對新疆阿克蘇地區鹽堿地細菌類群多樣性分析發現21個屬，其中僅有芽孢桿菌屬(Bacillus)與研究結果一致，其余菌屬均未在研究土壤中沒有發現。雖然土壤類型均為鹽堿土壤，但是由于所處地區不同，鹽堿化輕重不一樣，植被覆蓋類型不同，導致土壤微生物群落結構也會有所不同[35-37]。

3.3 土壤微生物群落與土壤理化性質及肥力之間的關系

土壤微生物作為植物多樣性和陸地生態系統的生產力的重要驅動因素[38]，已有研究表明了土壤因子對于土壤微生物群落組成的重要性[39-40]。在研究中，物種與土壤堿解氮和速效磷呈顯著相關。Liljeroth等[41]研究證明氮肥施用增加了細菌群落密度。氮是土壤微生物中關鍵限制因素，氮肥對于微生物群落具有重要的影響[42]。Ramirez等[43]研究發現放線菌種群與N呈正相關關系，在試驗中堿解氮與放線菌之間無顯著相關性，可能是由于荒地開墾一年內堿解氮對于放線菌沒有影響，還需要后續進一步試驗進行驗證。土壤速效磷作為土壤中可被吸收的磷組分，可以影響土壤微生物磷的利用率，與土壤微生物密切相關[44]。牛世全等[45]研究發現速效磷與綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、放線菌門、擬桿菌門呈正相關，在研究中，速效磷僅與浮霉菌門呈正相關，與厚壁菌門呈負相關。Lei等[46]研究發現有效磷與厚壁菌門呈負相關，與研究中結果一致。

4 結 論

4.1 不同油菜品種間土壤理化性質有所差異。其中以油菜品種16-P22外在降低土壤pH、提高土壤堿解氮、速效磷和有機質方面表現最好；油菜品種金油158降低土壤電導率最低；油菜品種1對土壤速效鉀含量提升效果最佳。

4.2 不同油菜品種土壤樣本間shannon指數和simpson指數有顯著差異，Chaol和ACE指數間無顯著性差異，其中油菜品種16-P22外土壤微生物豐富度和多樣性指數較高。

4.3 各樣本土壤優勢菌門類為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門；土壤樣本16-P22外Pontibacter屬相對豐度較其它三個樣品最高，該品種在鹽堿土壤上有較好的適應性。堿解氮、速效磷是影響土壤微生物菌門豐度的主要因素。