新疆主栽骨干棉花品種指紋圖譜構建及純度鑒定

布卡·歐爾娜,張 文,曾慶濤,馬麗娟,逯 濤,蔡曉莉,趙富強

(新疆生產建設兵團第七師農業科學研究所，新疆奎屯，833200)

0 引 言

【研究意義】新疆已審定的棉花品種數量較多，其中新陸早6號、新陸早33號及新陸早36號為3個主推骨干品種。新陸早6號是由新疆生產建設兵團第七師農業科學研究所于1996年選育出的早熟豐產優質棉花新品種，累計推廣面積60×104hm2(900萬余畝)為早熟棉區主栽品種之一；新陸早33號是由新疆農墾科學院棉花研究所于2007年選育出的早熟優質抗病棉花新品種，累計推廣面積66.67×104hm2(1 000萬余畝)，新陸早36號是由新疆生產建設兵團第八師農業科學研究所于2007年選育出的早熟豐產耐病新品種，累計推廣面積53.33×104hm2(800萬余畝)，系62號是由新疆生產建設兵團第七師農科所于2017年選育出的示范品系，是國審棉Z1112姊妹品系。近年來，由于棉花長期遺傳定向改良，親本數量有限且反復集中使用，致使我國棉花品種的遺傳基礎較為單一，只靠傳統的生物學性狀很難將其準確區分鑒別[1]。構建新疆主栽骨干棉花品種的指紋圖譜，對棉花分子育種具有實際意義。【前人研究進展】近年來，DNA分子標記的發展使棉花品種鑒定進入基因水平，其中SSR標記具有多態性高、共顯性遺傳的特點，成為棉花品種鑒定研究的熱點[3]。前人已有很多的報道采用SSR標記技術開展棉花品種指紋圖譜的構建及遺傳多樣性的研究。例如，Diqiu Liu等[4]對我國棉花遺傳多樣性進行了微衛星分析。Iqbal等[5]對1個亞洲棉品種和22個陸地棉品種進行RAPD分析，認為陸地棉品種的遺傳基礎很小。馮艷芳等[6]基于SSR標記構建了20個棉花品種的指紋圖譜。賀道華等[7]利用分布于全基因組的SSR標記評價了92份包括陸地棉、海島棉、亞洲棉在內的棉花資源的遺傳多樣性。田琴等[8]利用SSR分子標記法分析了12個早熟陸地棉親本遺傳距離及雜種優勢。李育強等[9]利用SSR分子標記方法構建湘雜棉系列棉花的指紋圖譜。吳大鵬等[10]對四個國家海島棉品種資源的親緣關系及遺傳多樣性進行了研究。薛艷等[11]利用SSR標記構建了新疆早熟棉品種的指紋圖譜。劉國棟等[12]采用SSR引物對51個常規棉品種進行了基因純度鑒定、遺傳聚類分析和品種特異性鑒定。聶新輝等[13,14]構建了新疆2013年前審定的51個新陸早常規棉品種和23個彩色棉品種的DNA指紋圖譜，并進行了遺傳多樣性分析。近年來，利用SSR標記也構建了小麥[15]、水稻[16]、大豆[17]、玉米[18]、煙草[19]等農作物的DNA指紋圖譜數據庫。【本研究切入點】當前棉花品種純度和真實度多是通過田間小區種植的方法鑒定的，此法費時費力，操作復雜，且受環境影響較大[2]。選用新疆4個骨干棉花品種，構建棉花品種的指紋圖譜，棉花品種純度進行分析研究。【擬解決的關鍵問題】采用SSR分子標記技術通過構建棉花品種的指紋圖譜及純度檢測，為棉花品種提供分子理論依據，為主推骨干親本指紋圖譜構建提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

棉花品種新陸早6號、新陸早33號、新陸早36號、系62號均由第七師農科所提供。SSR引物由上海生工合成，植物DNA提取試劑盒、2×EsTaqMasterMix(Dye)購自康為世紀生物有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2 .1 DNA提取及SSR檢測

4個棉花品種各取20 粒去殼種子，用研缽棒壓碎后分別轉入2 mL的離心管中，用植物DNA提取試劑盒提取棉花基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA，驗證DNA的完整性。

SSR-PCR擴增。采用10 μL PCR擴增體系：模板DNA 1 μL；ddH2O 5.2 μL，2×EsTaqMasterMix(Dye) 3 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL。PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性45 s，退火溫度(50～60 ℃)退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃延伸7 min；4℃保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳。擴增產物生物非變性8%(質量分數)的聚丙烯酰胺凝膠電泳。每個孔點樣品2.5 μL，150 V電壓1 h。固定5 min、滲透8 min、顯色5 min，終止反應。

綜合全面評價已有的1 000多對引物，選擇擴增清晰穩定、多態性高、帶型統計容易的標記引物65對，對參試品種再次篩選，最后確定核心引物25對。

1.2 .2 指紋建立

按照PCR擴增產物在聚丙烯酰胺電泳凝膠上的譜帶位置，對每對引物形成的不同基因型進行編號記錄，建立4份棉花品種的DNA分子指紋圖譜。電泳結果采用數字0、1讀取，同一位置有帶的記為1，無帶的記為0，然后將每對引物在品種間擴增得到的二進制(0、1)數據轉化為十進制數據，則該十進制數據表示每個引物擴增的結果，每4個引物組合形成的十進制數字串就是每一個品種的數字指紋圖譜。

1.2 .3 純度檢測

從4個供試樣品中分別隨機選擇20個單株作為樣本。根據引物篩選結果，分別選取10對核心引物進行純度檢測。

1.3 數據處理

各引物對應不同基因型擴增，計算位點多態性信息含量(Polymorphism information content,PIC)，按公式PIC=1-∑Pi2計算，其中Pi指第i個等位變異出現的頻率。品種純度P=(NT-ND)/NT×100%，式中NT為供試品種總株數，ND為雜株數，以平均值表示該品種的純度值。

2 結果與分析

2.1 SSR核心引物確定及引物信息

研究表明，25對核心引物在4份供試材料中檢測到基因型位點數70個，每對引物檢測到的基因型位點數在2～7個，平均2.8個。其中基因型個數大于平均數的引物有11個，編號分別為2、3、5、7、8、11、12、13、18、20、25。NAU1103在4份材料中擴增出基因型個數為3個，NAU1322在在4份材料中擴增出基因型個數為2個。圖1

標記間的PIC值在0.169 0～0.872 9，平均為0.688 3，其中PIC值大于平均數的標記有17個，引物編號分別為1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25，表明這些標記具有較高的多態性，有利于指紋圖譜的構建。

基因型個數和PIC值均大于平均數的引物有7個，如NAU1103，等位基因數與基因型個數分別為5和3，PIC值為0.830 0，證明了挑選的核心引物有效性高，鑒別品種能力強。表1,圖1

表1 25對SSR標記引物多態性信息
Table 1 Polymorphism information of 25 SSR loci

引物編號Primer number引物Primer等位基因數No.of alleles基因型個數No.of genotypesPIC1NAU1190420.773 42BNL1317570.872 93CIR307240.705 54NAU1102420.781 35Gh277340.780 66Gh132120.304 77NAU1103530.830 08NAU2631230.576 09NAU3096320.521 610NAU5426320.169 011NAU5064340.543 612BNL3590440.556 513BNL2646640.591 414DPL0528320.433 415MGHES-40520.815 016Gh111420.835 017Gh60420.812 518JESPR96530.835 019NAU1014520.842 520JESPR50530.835 021NAU2277320.708 322BNL1317420.773 423NAU5120320.750 024NAU1322420.796 925JESPR290630.764 1平均Average3.82.80.688 3

2.2 供試品種的指紋圖譜

采用25對引物對4個棉花品種進行指紋圖譜分析，得出4個棉花品種均具有其特征引物。在一定材料范圍內，某品種有著明顯區別于其他品種的特有指紋信息的引物被稱為特征引物。通過特征引物就可以直接區分該品種和其他品種。研究表明，新陸早6號有2個特征引物，新陸早33號有4個特征引物，新陸早36號有1個特征引物，系62有2個特征引物。可用4對核心引物的指紋信息構建4個棉花品種的指紋圖譜。表2

P1:引物 NAU1103P2:引物 NAU1322a,b,c,d：分別為新陸早6號、新陸早33號、新陸早36號、系62號四個棉花品種

P1: Primer NAU1103 P2: Primer NAU1322a,b,c,d：Four cotton varieties including Xinluzao 6, Xinluzao 33, Xinluzao 36 and Xi 62.

圖1 標記NAU1103、NAU1322在4份棉花中的電泳擴增等位基因特征
Fig.1 Alleles feature of marker NAU1103、NAU1322 in 4 cotton varieties

表2 4個棉花品種特征引物
Table 2 Specific primers for 4 cotton varieties

品種Variety特征引物Special primer新陸早6號 Xinluzao 6Gh60、NAU1014新陸早33號Xinluzao 33Gh111、NAU2277、BNL1317、CM45新陸早36號Xinluzao 36NAU5120系62 Xi 62NAU1103、NAU1190

表3 利用25對引物構建4份棉花品種的指紋信息
Table 3 DNA fingerprinting of 4 cotton varieties using 25 primers

品種VarietyDNA指紋DNA fingerprinting新陸早6號 Xinluzao 62-3-2-7-0-5-1-5新陸早33號Xinluzao 331-5-3-1-0-5-1-5新陸早36號Xinluzao 361-5-2-7-0-3-1-5系62 Xi 621-5-2-7-0-5-1-1

4 primers：NAU1014-Gh111-NAU5120-NAU1190

2.3 參試品種純度檢測

采用單位點平均法，分別從25對核心引物中篩選出10對引物，分析4個棉花品種純度。其中，基于指紋圖譜特征引物NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190應用于每一個品種的純度檢測中。

單個品種用10 個不同引物鑒定純度時，品種純度低于95%的引物有NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190、CIR307、NAU1102等6種，品種純度最低的引物為NAU1190，純度為88.75%；品種純度最高的引物為JESPR50、BNL2646、BNL1034、NAU1201，純度為100%，這幾個引物的品種鑒別能力較強。表3

表4 4個棉花品種純度檢測引物信息及純度分子鑒定
Table 4 Primer information of purity test and Purity of identified by molecular marker in 4 cotton varieties

品種Variety引物Primer純度Purity(%)新陸早6號 Xinluzao 6NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190、NAU1322、NAU1102、JESPR50、CIR307、NAU3096、MGHGS-4092.0新陸早33號Xinluzao 33NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190、NAU1322、NAU1102、NAU3096、NAU1201、CIR307、MGHGS-4097.0新陸早36號Xinluzao 36NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190、NAU1322、Gh60、CIR307、JESPR96、NAU2277、JESPR5098.0系62 Xi 62NAU1014、Gh111、NAU5120、NAU1190、NAU1322、BNL1034、NAU1102、NAU1103、BNL2646、BNL131799.5

研究表明，同一品種用不同引物檢測純度，其一致性帶型有一定差異。新陸早6號用10對引物檢測，其一致性變化范圍85%～100%，平均92%；新陸早33號用10對引物檢測的一致性變化范圍90%～100%，平均97%；新陸早36號用10對引物檢測的一致性變化范圍85%～100%，平均98%；系62號用10對引物檢測的一致性變化范圍95%～100%，平均99.5%。表4,圖2

新陸早6號的純度最低，為92.0%，系62號的純度最高，為99.5%。表4,圖2～5

圖2 引物NAU1014在20個單株(新陸早6號)的純度擴增
Fig.2 Amplified result of 20 plants of Xinluzao 6 with primer NAU1014

圖3 引物NAU1102在20個單株(新陸早33號)的純度擴增
Fig.3 Amplified result of 20 plants of Xinluzao 33 with primer NAU1102

圖4 引物Gh111在20個單株(新陸早36號)的純度擴增結果
Fig.4 Amplified result of 20 plants of Xinluzao 36 with primer Gh111

注:1～20:取同一品種的20個單株

Note:1-20:Take 20 individual plants of the same variety

圖5 引物NAU1190在20個單株(系62號)的純度擴增結果
Fig.5 Amplified result of 20 plants of Xi 62 with primer NAU1190

3 討 論

試驗選擇的4個主栽骨干品種具有典型代表性，代表區域多樣化。新疆北疆不同育種單位在早熟棉選育過程中逐漸形成了各自的特點及優勢，表現在各育種單位在基礎種質資源上確立了其特定的選育方向。試驗選擇的新陸早三個品種分別來自于不同的育種單位，且分布廣、推廣面積大，均為新疆主栽骨干品種，可代表不同的區域，具有特殊性。

研究以25對核心引物SSR標記擴增檢測到多態性基因型位點70個，其中報道顯示，張曉娟等[20]2011年用52對引物對95份棉花骨干種質資源遺傳多樣性進行分析，研究篩選的引物有7個與其相同，分別為NAU1190、NAU1102、Gh132、MGHES-40、Gh111、NAU2277、NAU1322，說明這些引物可重復性好，具有較強鑒別品種的能力；聶新輝等[13]2014年用51個新陸早棉花品種、75對引物構建了指紋圖譜，進行了遺傳多樣性分析，研究篩選的引物有8個與其相同，分別為NAU1190、BNL1317、CIR307、NAU1102、Gh277、Gh132、NAU1103、NAU2631；其中，研究與以上2篇文獻都相同的引物有3個，分別為NAU1190、NAU1102、Gh132，說明這3個引物多態性好，重復性高，且具有代表性和廣適性，可用于后續棉花品種純度鑒定及指紋圖譜的構建。另外，研究中NAU1190和BNL1317分別是新陸早6號和新陸早33號的特征引物，在聶新輝等的文章中，NAU1190和BNL1317分別是新陸早23號和新陸早34號的特征引物，與前人的研究相比較，研究鑒別的這兩個引物多態性好，鑒別品種能力強。

朱美霞等[21]認為純度較高的棉花品種只需要2～4對引物即可獲得準確的檢測結果；對于純度較低的品種，則需要5～10對引物才能獲得比較準確的檢測結果。而研究利用10個核心引物及單位點平均法統計樣品純度。

試驗結果顯示，新陸早6號在4個品種中純度最低，為92.0%，系62號純度最高，為99.5%。這可能是因為隨著選育時間的延長，品種純度降低。新陸早6號于1996年選育出，經過20多年培育，其品種純度逐年有所降低，而系62號為新品種，還未經過長時間的培育，其品種純度自然較高。

4 結 論

4.1 以具有典型代表性的新疆北疆早熟棉花主推骨干品種為材料，利用SSR分子標記技術，從1 000多對SSR引物中篩選出穩定性好、多態性高的25對核心引物，篩選出的25對核心引物具有代表性和廣適性，可以用于其他品種指紋圖譜的構建及純度鑒定。

4.2 采用25對引物對4個棉花品種進行指紋圖譜分析，得出4個棉花品種均有其特征引物，分別利用4個特征引物將4份品種一次性完全區分開，并構建了供試品種的指紋圖譜。品種指紋圖譜的構建，可以快速、準確地鑒別各個品種的真偽。

4.3 從核心引物中篩選出10對引物作為標記，分析得出了4個棉花品種的純度。SSR標記檢測品種純度的方法不受環境影響、所需時間短、精度高、重復性穩定。該結果在DNA水平上反映了鑒定品種的位點一致性情況，可以作為田間純度鑒定的有益補充。