3種蝦肝腸胞蟲PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用比較分析

葉 鍵，許 婷，施禮科，陳 凡，王 力，陳 喆，章秋虎，郭水榮

(1.杭州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310017； 2.紹興文理學(xué)院，浙江 紹興 312000 )

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)屬微孢子蟲科、腸胞蟲屬，是一種可感染多種真核生物的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。該病原最早于2004年作為一種未知微孢子蟲在泰國(guó)生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)肝胰腺小管上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1]，2009年在斑節(jié)對(duì)蝦的肝胰腺內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了這種微孢子蟲[2]。蝦肝腸胞蟲對(duì)世界各地的對(duì)蝦養(yǎng)殖已造成不同程度的損害，泰國(guó)、越南、印度、印度尼西亞和馬來(lái)西亞等地區(qū)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦、紅額角對(duì)蝦(P.stylirostris)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)均有該寄生蟲病發(fā)生的報(bào)道[2-8]，我國(guó)廣西[9]、浙江[10-11]、江蘇[12]、天津[13]、遼寧[14]等地亦有該寄生蟲檢出的報(bào)道。目前普遍認(rèn)為，養(yǎng)殖對(duì)蝦生長(zhǎng)遲緩與蝦肝腸胞蟲相關(guān)[13-16]，但患病對(duì)蝦并未停止攝食，空耗飼料、水電和人工等，由此造成的損失遠(yuǎn)大于對(duì)蝦死亡。除垂直傳播外，蝦肝腸胞蟲還可水平傳播，包括經(jīng)口攝食傳播[7]，或直接通過(guò)養(yǎng)殖水體在對(duì)蝦中進(jìn)行傳播[17]。因其生物學(xué)特性，至今尚未找到能殺滅或是控制其發(fā)展的有效藥物。因此，快速檢測(cè)及診斷技術(shù)的建立，是從源頭防控該病原感染的關(guān)鍵。

蝦肝腸胞蟲蟲體較小，光學(xué)顯微鏡常規(guī)鏡檢難以發(fā)現(xiàn)，使用分子生物學(xué)技術(shù)手段是目前可行的且具備靈敏、特異、快速等特點(diǎn)的檢測(cè)方法。針對(duì)蝦肝腸胞蟲檢測(cè)的PCR方法主要有18S-PCR法[5]、SSU-PCR法[2]和SWP-PCR法[20]，其中后兩種檢測(cè)方法為套式PCR方法，目前業(yè)內(nèi)對(duì)使用哪種方法尚無(wú)定論，考慮到特異性，諸多學(xué)者更傾向于使用SWP-PCR法。為比較3種方法在生產(chǎn)中的檢測(cè)效果，筆者采集不同來(lái)源的36個(gè)凡納濱對(duì)蝦苗種樣本、5個(gè)鹵蟲(Artemia)樣本及12個(gè)水體樣本，分別進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，旨在為蝦肝腸胞蟲的實(shí)際檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Premix ExTaq，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(日本)，DNA抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司(德國(guó))；引物合成于上海生工，具體序列見表1。36個(gè)凡納濱對(duì)蝦苗種樣本采集于杭州地區(qū)24個(gè)凡納濱對(duì)蝦淡化苗種場(chǎng)不同生產(chǎn)批次，標(biāo)記為樣本1～36，5個(gè)鹵蟲樣本采集于杭州市凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)5位養(yǎng)殖戶所購(gòu)商品化冰凍成體鹵蟲，標(biāo)記為樣本L1～L5，12個(gè)水樣采集于杭州市凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)外蕩河道12個(gè)地理位點(diǎn)，標(biāo)記為樣本S1～S12。

1.2 DNA的提取

凡納濱對(duì)蝦苗種取全蝦，鹵蟲取全蟲，水樣經(jīng)10 000 r/min離心1 min后取沉淀，按Qiagen試劑盒操作方法提取DNA，用50 μL滅菌雙蒸水洗脫。

表1 引物列表

1.3 PCR檢測(cè)

于PCR反應(yīng)管中，加入2×Premix Ex Taq 25 μL，滅菌雙蒸水19 μL，DNA模板4 μL，和上下游引物(濃度25 μmol/L)各1 μL，混勻離心后置于PCR儀上，參照文獻(xiàn)[2,5,20]中描述的方法分別對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 產(chǎn)物測(cè)序

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，切取陽(yáng)性片段，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后，交TaKaRa公司克隆測(cè)序，將所得序列通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

36個(gè)凡納濱對(duì)蝦苗種樣本檢測(cè)結(jié)果見圖1，5個(gè)鹵蟲樣本及12個(gè)水樣檢測(cè)結(jié)果見圖2。18S-PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本為5和L5；SSU-PCR第一步擴(kuò)增陽(yáng)性樣本為L(zhǎng)5，第二步擴(kuò)增陽(yáng)性樣本為1、2、3、4、5、7、15、24、29、30、33、34、35、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S6、S7和S11；SWP-PCR第一步擴(kuò)增陽(yáng)性樣本為L(zhǎng)5，第二步擴(kuò)增陽(yáng)性樣本為1、2、5、15、29、33、35、L5、S2和S11。

2.2 陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序所獲得序列長(zhǎng)度及BLAST結(jié)果見表2。18S-PCR及SWP-PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均正確。SSU-PCR在凡納濱對(duì)蝦樣本檢測(cè)中獲得的陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確；L3號(hào)鹵蟲樣本陽(yáng)性產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為167 bp，BLAST匹配結(jié)果為一種非蝦肝腸胞蟲的微孢子蟲，S1和S3號(hào)水樣陽(yáng)性產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為175 bp，BLAST匹配結(jié)果為一種非蝦肝腸胞蟲的微孢子蟲，其余陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均正確。

圖1 36個(gè)凡納濱對(duì)蝦苗種樣本檢測(cè)結(jié)果a:18S-PCR；b:SSU-PCR第一步擴(kuò)增；c:SSU-PCR第二步擴(kuò)增；d:SWP-PCR 第一步擴(kuò)增；e:SWP-PCR第二步擴(kuò)增；N:陰性對(duì)照；P:陽(yáng)性對(duì)照；M: DNA marker.

圖2 5個(gè)鹵蟲樣本及12個(gè)水樣檢測(cè)結(jié)果a:L1～L5號(hào)鹵蟲樣本18S-PCR；b:S1～S12號(hào)水樣18S-PCR；c:L1～L5號(hào)鹵蟲樣本SSU-PCR第一步擴(kuò)增；d:S1～S12號(hào)水樣SSU-PCR第一步擴(kuò)增；e: L1～L5號(hào)鹵蟲樣本SSU-PCR第二步擴(kuò)增；f:S1～S12號(hào)水樣SSU-PCR第二步擴(kuò)增；g:L1～L5號(hào)鹵蟲樣本SWP-PCR第一步擴(kuò)增；h:S1～S12號(hào)水樣SWP-PCR第一步擴(kuò)增； i:L1～L5號(hào)鹵蟲樣本SWP-PCR第二步擴(kuò)增；j:S1～S12號(hào)水樣SWP-PCR第二步擴(kuò)增；N:陰性對(duì)照；P:陽(yáng)性對(duì)照；M:DNA marker.

2.3 檢測(cè)結(jié)果比較

綜合以上結(jié)果，針對(duì)這52個(gè)樣本的蝦肝腸胞蟲檢測(cè)，18S-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為3.77%，SSU-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為32.7%，SWP-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為18.86%。18S-PCR在一步擴(kuò)增的靈敏度最好，在凡納濱對(duì)蝦苗種5號(hào)樣本中獲得陽(yáng)性條帶，而其他兩種方法均未見條帶。在第二步擴(kuò)增上，SSU-PCR的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但在檢測(cè)鹵蟲樣本時(shí)會(huì)出現(xiàn)167 bp的假陽(yáng)性條帶，在檢測(cè)水樣時(shí)會(huì)出現(xiàn)175 bp的假陽(yáng)性條帶；在靈敏度不及SSU-PCR的情況下，SWP-PCR擴(kuò)增的特異性較好，未出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶。

表2 陽(yáng)性條帶測(cè)序長(zhǎng)度及BLAST比對(duì)結(jié)果

3 討 論

3.1 不同檢測(cè)方法的靈敏度差異

在凡納濱對(duì)蝦苗種的檢測(cè)中，能否最大限度辨別出陽(yáng)性苗種最為關(guān)鍵，也最受關(guān)注，直接影響到養(yǎng)殖生產(chǎn)的成敗。目前已報(bào)道的檢測(cè)方法主要包括顯微觀察法、普通PCR檢測(cè)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[10,15]、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法[5]和LAMP法[18]。不同的檢測(cè)方法在靈敏度上存在著一定的差異。LAMP法和TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[10]靈敏度為套式PCR的10倍。SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[15]靈敏度為套式PCR的4倍。在套式PCR檢測(cè)到蝦肝腸胞蟲的樣品中，只有第一步PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性的樣品，才能在肝胰腺組織中用光學(xué)顯微鏡觀察到可辨識(shí)的孢子[6]。考慮到檢測(cè)時(shí)限、高通量檢測(cè)成本、水產(chǎn)養(yǎng)殖基層實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、結(jié)果可靠性等因素，普通PCR方法仍然是目前生產(chǎn)領(lǐng)域最為實(shí)用的檢測(cè)技術(shù)。

Jaroenlak等[19]根據(jù)孢壁蛋白SWP序列設(shè)計(jì)引物，建立了套式SWP-PCR檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SWP-PCR的第一步擴(kuò)增靈敏度比SSU-PCR高100倍，在第二步擴(kuò)增上，兩者的靈敏度無(wú)顯著差異。但通過(guò)實(shí)際檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在未知樣本的檢測(cè)上，SSU-PCR第二步擴(kuò)增的靈敏度要顯著高于SWP-PCR，并且只有SSU-PCR第二步擴(kuò)增條帶相對(duì)較亮的樣本，SWP-PCR第二步擴(kuò)增才能獲得相應(yīng)條帶。可能產(chǎn)生這種結(jié)果的原因?yàn)椋湟詷?biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行了比對(duì)試驗(yàn)，在實(shí)際檢測(cè)中，還存在目的序列的基因豐度差異，這種差異往往直接影響了實(shí)際檢測(cè)的靈敏度。由于凡納濱對(duì)蝦苗種中蝦肝腸胞蟲的攜帶量較低，往往要依靠套式PCR的第二步擴(kuò)增才能檢出，因此SSU-PCR更適合苗種中蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)。

3.2 SSU-PCR假陽(yáng)性條帶對(duì)實(shí)際檢測(cè)的影響

已有報(bào)道表明，SSU-PCR應(yīng)用于魚粉等原料的檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)在檢測(cè)蟹類樣品時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，并且假陽(yáng)性條帶的位置與目的條帶的位置不易區(qū)分[19]。筆者在檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，SSU-PCR在第二步擴(kuò)增上確實(shí)存在著一些假陽(yáng)性現(xiàn)象，鹵蟲中檢出的假陽(yáng)性物種為其他種的微孢子蟲，水中檢出的假陽(yáng)性條帶為一種寄生搖蚊的微孢子蟲[20]。由于目前未報(bào)道養(yǎng)殖對(duì)蝦可被這些產(chǎn)生交叉反應(yīng)的物種感染，因此針對(duì)對(duì)蝦的蝦肝腸胞蟲檢測(cè)，SSU-PCR仍是可信任的方法。

凡納濱對(duì)蝦取樣時(shí)，往往體表會(huì)留有一定量的水，這些水中可能存在的上述假陽(yáng)性物種是否會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有干擾，筆者認(rèn)為其可能性也不大。由于在檢測(cè)的過(guò)程中對(duì)水樣進(jìn)行檢測(cè)時(shí)首先要進(jìn)行離心，可以視為一定程度上的濃縮，才能在套式PCR的第二步擴(kuò)增中觀察到條帶，而凡納濱對(duì)蝦苗種取樣后，一般會(huì)加一定量的95%乙醇保存，這是對(duì)殘留水的一次稀釋，之后實(shí)際檢測(cè)中會(huì)剔除這部分乙醇，這又是一次稀釋，即便是未能完全剔除，其含量也可忽略不計(jì)，通過(guò)套式PCR的方法也已檢測(cè)不到。有鑒于此，在針對(duì)凡納濱對(duì)蝦苗種進(jìn)行蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)時(shí)，推薦采用靈敏度更高SSU-PCR的方法；在針對(duì)餌料生物、環(huán)境樣本等進(jìn)行蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)時(shí)，推薦采用特異性更好的SWP-PCR方法。

3.3 蝦肝腸胞蟲的多種攜帶渠道值得引起高度重視

已有研究表明，在海水[9]、感染塘池水及冰凍鹵蟲[5]中均能不同程度檢測(cè)到蝦肝腸胞蟲的存在；通過(guò)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，市售商品化冰凍鹵蟲和凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)周邊水域中均能檢測(cè)到蝦肝腸胞蟲，這與已有的報(bào)道吻合。鹵蟲為凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的重要?jiǎng)游镄责D料，而對(duì)蝦的養(yǎng)殖用水大多取自周邊的主要河道，同時(shí)凡納濱對(duì)蝦苗種階段蝦肝腸胞蟲的攜帶率又較高，種種因素表明，凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖暴露在蝦肝腸胞蟲存在的大環(huán)境下，面臨著較大的系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)其防控存在著較大難度，相關(guān)從業(yè)者要引起高度重視，從生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控，以確保養(yǎng)殖生產(chǎn)的成功。