4株凡納濱對蝦腸道益生菌分離、鑒定及應用研究

鄭軍榮，羅 婷，李志強，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術開發應用工程研究中心，福建 福州 350007 )

科技進步使對蝦養殖業得到飛速發展，但高密度的大規模養殖引發了新的問題，如環境污染、水質惡化使病害頻發從而導致對蝦產率低[1]。對由病毒[2]、細菌[3]或寄生蟲[4]等引起的病害最常用的手段是使用抗生素，而大量盲目使用抗生素在病害得到一定程度控制的同時養殖體系的微生態環境也遭到嚴重破壞，且抗生素殘留對人體健康的影響也日趨嚴重。因此，尋找綠色健康的養殖模式勢在必然。有研究報道，微生物在水產養殖生態環境系統中起著至關重要的作用[5-6]。因此，利用微生物來改善養殖生態環境，提高對蝦自身的免疫力已成為新的研究熱點[7-10]。

目前，微生態制劑已用于對蝦的養殖，但養殖過程中添加益生菌制劑的效果不如人意[11]。除了菌株是否真正具有所謂的抗弧菌、抗致病菌和病毒等功能以外，菌株能否在對蝦腸道內定殖也是一個很關鍵的問題。由于不同品種的對蝦腸道微生物菌群結構和特性并不相同，能發揮效能的益生菌不僅與來自陸地的種類有差異，且不同對蝦腸道間的菌群種類也各不相同[12-14]。因此，自養殖的對蝦腸道直接分離篩選有益微生物用于對蝦的養殖則更具價值。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是我國最主要的養殖對蝦之一，筆者旨在通過利用乳酸菌培養基對凡納濱對蝦腸道中的益生菌進行分離、分子生物學鑒定，并利用體外抗菌的方法篩選有抗菌活性的菌株，獲得1～2株抗性菌用于對蝦室內養殖研究，為今后大規模推廣提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康凡納濱對蝦成蝦(6～7 cm)和仔蝦(1～2 cm)樣品采集于福建某凡納濱對蝦養殖基地；對蝦病原菌株副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)由集美大學實驗室提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和沙門氏菌(Samonella)由本實驗室保存。Ezup柱式細菌和真菌基因組DNA抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR及測序引物(ITS基因正向ITS5和反向引物ITS4；16S rDNA基因正向引物27F和反向引物1492R)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；糞便基因組DNA提取試劑盒購于天津天根公司；乳酸菌培養基購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和蝦腸道的預處理

將仔蝦和成蝦分別裝在無菌的三角瓶中取回。取饑餓1 d后腸道無明顯糞便的對蝦，用無菌水沖洗后，以75%的酒精浸泡10 min，再用無菌水沖洗，隨后用無菌牙簽將整個腸道取出，放入研磨器中研磨，制成勻漿液。

1.2.2 蝦腸道中的微生物分離及純化

均質樣品進行梯度稀釋，取0.1 mL的各稀釋液，涂布到乳酸菌培養基平板上，30 ℃厭氧培養約48 h，挑取不同形態的單菌落進行純化。

1.2.3 分離菌株的形態學鑒定

純化單菌落分別接種到乳酸菌培養基上培養，觀察菌落形態與生長狀態。挑取菌落用革蘭氏染色，顯微鏡觀察細胞形態結構，并根據菌株的菌落形態和顯微鏡下特征進行初步分類。

1.2.4 分離菌株的分子生物鑒定

細菌用細菌DNA試劑盒提取DNA后，PCR擴增16S rDNA序列(引物27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)；酵母用真菌DNA提取試劑盒提取DNA后，擴增ITS序列(引物ITS5為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS4為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)；采用文獻[15]的方法進行擴增。擴增的DNA片段進行序列測定(委托上海生工完成)。將獲得的菌株ITS序列在美國國立生物技術信息中心的GenBank進行比對,16S rDNA序列在Ezbiocloud中比對，初步確定同源性很高的種屬，隨后將所得序列與初步確定種的模式菌株序列運用Mega 5.0構建系統發育進化樹，進一步確定最接近的種屬。

1.2.5 分離菌株的抗菌活性

分離菌株、病原菌分別用肉湯液體培養基培養24 h，菌株生長良好。取病原菌0.1 mL涂布于相應的固體培養基上，隨后將滴加了10 μL分離菌菌液的無菌小圓形濾紙貼于其上，培養約48 h觀察抑菌情況。

1.2.6 部分菌株復合飼料對對蝦生長的影響

選擇抑菌效果好的2株菌用液體培養基進行振蕩富集培養24 h，離心獲取菌體進行冷凍干燥，取凍干菌渣與飼料混合或包埋制成108cfu/g的2種不同的益生菌復合制劑。模擬室外條件，塑料收納箱中水體溫度28 ℃、鹽度20、pH 7.0～8.0、溶解氧7.0～8.0 mg/L、對蝦養殖密度200 尾/m2，同時用添加2種不同的益生菌復合制劑飼料以不同方式喂養仔蝦，以直接投喂飼料為對照組，每組2個平行。早晚各投喂1次，投喂量約為蝦體質量的10%，定期補水，2個月后觀察對蝦的成活情況。

1.2.7 益生菌飼養對蝦對弧菌的抵抗力以及腸道菌群的影響

將不同方式喂養的對蝦分成兩部分，對其中一部分對蝦用終密度105cfu/mL副溶血弧菌侵染，觀察侵染7 d后對蝦的存活情況。隨后用糞便基因組DNA提取試劑盒提取侵染和未侵染弧菌的對蝦腸道DNA，對腸道菌群16S rDNA區段高通量測序(杭州晶佰生物科技公司)，比較菌群差異。

2 結 果

2.1 菌株的分離與篩選

通過用乳酸菌培養基對凡納濱對蝦腸道微生物進行分離篩選，共獲得7株菌，其中4株芽孢桿菌、1株酵母菌和2株腸球菌。經過初步的抗性試驗，最終選定1株酵母菌和3株芽孢桿菌(W7、W25、W27、W31)作為進一步的研究對象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態學鑒定

菌株W7、W25、W27、W31在乳酸菌培養基上的菌落形態和顯微形態見圖1。菌株W7菌落為圓形，淺黃色，隆起，光滑，濕潤，G+，細胞為卵圓形或橢圓形，出芽生殖，可以初步確定菌株W7是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。菌株W25菌落極小為圓形，淺黃色，微凸，表面濕潤，G+，細胞為短小桿狀，部分有芽孢。菌株W27菌落圓形，淺黃色，扁平，表面粗糙，邊緣不規則，G+，細胞為桿狀，部分有芽孢。菌株W31菌落為圓形，灰白色，邊緣不規則，表面皺褶，中間微凸，干燥，G+，細胞為桿狀，有芽孢。由菌落形態和顯微形態確定菌株W25、W27和W31是芽孢桿菌(Bacillus)。

2.2.2 分離菌株的分子生物鑒定

對菌株W7擴增ITS序列片段約為800 bp，測序后美國國立生物技術信息中心中Blast分析，結果只有與啤酒酵母有很高的同源性(96%)，結合形態學進一步確定其為啤酒酵母菌。

對3株芽孢桿菌擴增16S rDNA序列，大小約1500 bp、經測序后在Ezbiocloud中分析，結果每株都有幾個與其同源性在99%以上的種(表1)。利用3株菌及相似種的模式菌株的16S rDNA序列構建系統發育樹，根據系統發育圖分析發現，菌株W25與短小芽孢桿菌 (B.pumilus) ATCC7061(ABRX01000007)的進化距離最近，同源性為99.93%；菌株W27與枯草芽孢桿菌沙漠亞種(B.subtilisssp.inaquosorum) KCTC13429(AMXN01 000021)的進化距離最近，同源性為99.93%；菌株W31與暹羅芽孢桿菌(B.siamensis) KCTC 13613(AJVF01000043)的進化距離最近，同源性為99.93%(圖2)。因此，結合形態學可以初步確定菌株W25與短小芽孢桿菌ATCC7061為同一種；菌株W27與枯草芽孢桿菌亞種KCTC13429為同一種；菌株W31與暹羅芽孢桿菌KCTC13613為同一種。

圖1 4株菌在乳酸菌培養基上的菌落形態和顯微鏡下形態(革蘭氏染色)

菌株編號相似菌株登錄號相似性/%錯配/總數W25短小芽孢桿菌ATCC7061ABRX0100000799.931/1404南海芽孢桿菌 (B. australimaris) NH7I_1JX68009899.862/1404沙福芽孢桿菌(B. safensis)FO-36bASJD0100002799.862/1404高地芽孢桿菌(B. altitudinis)41KF2bASJC0100002999.576/1404廈門芽胞桿菌(B. xiamenensis )HYC-10AMSH0100011499.507/1404萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)JCM9070AB02118197.2938/1404暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004397.0841/1404W27特基拉斯芽孢桿菌(B. tequilensis)KCTC13622AYTO0100004399.931/1404枯草芽孢桿菌沙漠亞種KCTC13429AMXN0100002199.931/1404枯草芽孢桿菌枯草亞種(B. subtilis ssp. subtilis)NCIB3610ABQL0100000199.862/1404薄壁芽孢桿菌(B. halotolerans)ATCC25096LPVF0100000399.793/1404枯草芽孢桿菌亞種(B. subtilis ssp. spizizenii)NRRLB-23049CP00290599.793/1404

續表1

菌株編號相似菌株登錄號相似性/%錯配/總數W27中田芽孢桿菌(B. nakamurai)NRRLB-41091LSAZ0100002899.724/1404莫海威芽孢桿菌(B. mojavensis)RO-H-1JH60028099.724/1404死谷芽孢桿菌(B. vallismortis)DV1-F-3JH60027399.576/1404暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004399.576/1404萎縮芽孢桿菌JCM9070AB02118199.349/1404W31暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004399.931/1358枯草芽孢桿菌枯草亞種NCIB3610ABQL0100000199.783/1358解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)DSM7FN59764499.714/1358中田芽孢桿菌NRRLB-41091LSAZ0100002899.635/1358特基拉斯芽孢桿菌KCTC13622AYTO0100004399.566/1358枯草芽孢桿菌沙漠亞種KCTC13429AMXN0100002199.566/1358死谷芽孢桿菌DV1-F-3JH60027399.487/1358薄壁芽孢桿菌ATCC25096LPVF0100000399.418/1358枯草芽孢桿菌亞種NRRLB-23049CP00290599.418/1358萎縮芽孢桿菌JCM9070AB02118199.418/1358

圖2 菌株W25、W27、W31的16S rDNA系統發育樹

2.3 分離菌株的抗菌特性

對4株菌株進行體外抗副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的試驗。試驗結果可知，啤酒酵母W7對副溶血弧菌和沙門氏菌有抑菌效果，但是抑菌圈不透明，仍有部分細菌生長，抑菌作用不明顯，而對金黃色葡萄球菌的抑菌圈明顯透明，抑制作用明顯。短小芽孢桿菌W25和枯草芽孢桿菌沙漠亞種W27對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，但對沙門氏菌抑菌效果不明顯，暹羅芽孢桿菌W31對3株病原菌均有明顯抑制作用，且暹羅芽孢桿菌W31的抑菌透明圈最大，效果最好(表2)。

表2 分離菌株對不同病原菌的抑制效果

2.4 部分菌株復合飼料對對蝦生長的影響

選擇啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31發酵的菌體凍干后與飼料做成兩種益生菌劑，以普通飼料(對照)、混合益生菌劑、包埋益生菌劑及混合益生菌劑+普通飼料同時飼養這幾種不同的方式喂養幼蝦。2個月后發現益生菌飼養的對蝦組的成活率均相對高于普通飼料投喂的對照組(表3)。

表3 啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31益生菌飼料對對蝦成活率的影響

2.5 益生菌飼養對蝦對弧菌的抵抗力以及腸道菌群的影響

對試驗組1、2、3、4中每組2個平行中的1個平行進行副溶血弧菌侵染，依次編號為5、6、7、8。7 d后，投喂普通飼料的對照組(試驗組5)的死亡率最高，明顯高于投喂益生菌的試驗組(表4)。

表4 益生菌飼養對蝦對弧菌的抵抗力

對未侵染副溶血弧菌的各試驗組(1～4)及侵染副溶血弧菌的各試驗組(5～8)的對蝦腸道微生物進行16S rDNA測序分析，結果見圖3。由圖3可知，未侵染試驗組中無弧菌，而所有侵染試驗組中均有弧菌。對未侵染試驗組的菌群分析發現，與未添加益生菌的試驗組1相比，添加益生菌的試驗組2～4中芽孢桿菌的豐度并未明顯增加，但是氣單胞菌屬(Aeromonas)和變形桿菌屬(Proteus)豐度變小了，γ-變形桿菌綱和希瓦氏菌屬(Shewanella)豐度增加了，而且含有試驗組1中未出現的菌群，說明益生菌的添加確實能夠明顯地影響對蝦腸道菌群的結構。侵染試驗組5～8的菌群分析結果顯示，不同方式飼養的對蝦腸道的弧菌豐度有明顯的差異，其中普通飼料試驗組5中弧菌含量最高，混合益生菌試驗組6中弧菌最少，這說明益生菌在一定程度上抑制了弧菌的生長。

圖3 多個對蝦腸道樣品菌群分布1～8對應表3和表4中相應試驗組的腸道樣品菌群.

3 討 論

有研究報道,對蝦腸道微生物的組成和數量與其發育時期、養殖模式和生存環境變化有很大的相關性[16]。本試驗前期對不同階段凡納濱對蝦腸道及其水體中可培養的微生物進行了比較研究，確定其腸道和水體中的微生物有一定的相關性。盡管不同時期對蝦腸道中的微生物有一定的差異，但均有腸球菌、酵母菌和各種芽孢桿菌，這些菌類可能是對蝦腸道中的優勢菌。

利用特定的培養方式能夠自大量的微生物中快速分離目的菌株，分子生物學方法能在短時間內對大量菌株快速鑒定到屬種，是目前一種快速短時獲得目的菌株的有效手段[17-18]。乳酸菌是對蝦腸道內重要的微生物菌群，對其健康至關重要。乳酸菌培養基是分離腸道中各種乳桿菌、乳球菌的主要培養基，本試驗利用乳酸菌培養基自對蝦腸道中不僅快速分離到幾種不同的腸球菌，還分離到酵母菌和芽孢桿菌。雖然起初目的是大量分離各種乳桿菌，結果卻分離到腸球菌。對從腸道上分離到芽孢桿菌和酵母菌實屬意外，說明對蝦腸道內存在著一定數量的酵母菌和芽孢桿菌，這些菌株也適合在乳酸菌培養基上生長。其中W7、W25、W27和W31 這4株不同形態的菌株，經形態學鑒定初步確定為1株啤酒酵母，3株芽孢桿菌。利用ITS和16S rDNA測序對這4株菌進行快速鑒定，確定菌株W7為啤酒酵母，菌株W25為短小芽孢桿菌，菌株W27為枯草芽孢桿菌沙漠亞種，菌株W31為暹羅芽孢桿菌。這些菌株并非新種，但不同來源的同種菌株也具有株間功能性差異，因此有一定的研究價值。分子生物學鑒定分析有優勢也有缺陷，本試驗確定的4株菌與已知菌株的同源性研究還需進一步試驗。

此外，菌株在應用之前確定是否具有某種功能，采用抗性篩選是獲得有益菌目的菌株的手段之一，并已取得了良好的效果[19-21]。利用病原菌副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌對獲得的4株菌的體外抑菌功能進行考察，結果發現，啤酒酵母W7對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，但對其他2株菌的抑制作用不明顯；短小芽孢桿菌W25和枯草芽孢桿菌沙漠亞種W27對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，但對沙門氏菌作用不明顯；暹羅芽孢桿菌W31對3株病原菌均有抑制作用，且抑菌效果最好。進一步說明這些菌株產生的某種物質可能對致病菌的繁殖有不同程度的抑制作用，因此，添加益生菌可以調控對蝦養殖環境中致病菌的生長，從而改善養殖條件。

有研究報道，益生菌復合使用具有協同作用，比單菌的效果更好[18]。已有的研究表明，對蝦養殖中添加外源益生菌，對養殖水體和腸道菌群有明顯影響，能夠一定程度上提高對蝦的生長速率、免疫力、抗病力或抗氨氮能力[22-24]。本試驗利用啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31的菌體與基礎飼料混合喂養對蝦，能夠明顯地提高對蝦的成活率以及對弧菌的抵抗力。對蝦的腸道菌群分析發現，益生菌的添加未必能明顯地提高相應菌的含量，但可以改變腸道菌群中氣單胞菌屬、變形桿菌屬和希瓦氏菌屬等的豐度以及菌群結構的組成。氣單胞菌為條件致病菌，其豐度減少可在一定程度上降低對蝦的死亡率。此外，菌群結構的變化也可能會改變對蝦自身的免疫力及對不利環境的抵抗能力，從而提高成活率。進一步的試驗也發現，益生菌的添加在一定程度上抑制了弧菌的繁殖，減少了弧菌的豐度，進而降低了對蝦體的攻擊力度，從而降低對蝦的死亡率。據此可以確定，益生菌制劑能夠改變對蝦腸道的菌群，也可在一定程度上抑制弧菌的繁殖，但兩者之間是否有必然聯系則需進一步的研究。試驗也說明，利用來自對蝦腸道的菌株制成對蝦益生菌飼料確實可行，為進一步開發對蝦微生態制劑奠定了基礎。但是這些菌株在投喂中的具體作用機理、是否適用于大規模室外投喂以及投喂方式和最佳劑量等問題有待于進一步的研究。