鎘、汞暴露在中華絨螯蟹卵巢中的富集及其氧化應(yīng)激反應(yīng)

陳潤(rùn)琦 葉方源 林錦煌 周佳儀 蔡佳佳 應(yīng)雪萍

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 溫州 325027)

隨著沿海經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展, 水體日趨嚴(yán)重的重金屬污染將對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生一定的毒害作用[1—3]。研究顯示, 海洋環(huán)境中Cd2+、Hg2+、Cr2+、Pb2+等重金屬含量較高, 其中Hg2+和Cd2+被列為重點(diǎn)重金屬污染物之一[2,4]。Cd2+和Hg2+暴露會(huì)使動(dòng)物組織產(chǎn)生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS),ROS可以與體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸反應(yīng), 引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化, 導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[5—8]。其中, 丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷以及凋亡的重要指標(biāo)[9—11]。生物體在進(jìn)化過(guò)程中具備有效的抗ROS防御體系,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等[9,12—13]。研究表明,Cd、Hg等重金屬可以改變動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶(SOD、GPx、CAT)活性, 降低細(xì)胞對(duì)自由基及其產(chǎn)物的清除能力[6,14—15]。金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸的胞內(nèi)蛋白質(zhì),具有較強(qiáng)的重金屬解毒和調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力[16],MT在轉(zhuǎn)錄水平上易被重金屬所誘導(dǎo), 且與重金屬濃度相關(guān), 能有效地反映動(dòng)物受重金屬脅迫程度[17—19]。

重金屬對(duì)水生動(dòng)物雌性生殖細(xì)胞的毒性較為敏感且影響深遠(yuǎn)[1,20—22]。汞和鎘會(huì)影響水生動(dòng)物卵巢結(jié)構(gòu)、延遲卵巢的發(fā)育和成熟、降低卵的孵化率, 并使卵巢產(chǎn)生氧化損傷[21—26]。中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱河蟹, 屬甲殼綱(Crustacea),方蟹科(Grapsidae), 絨螯蟹屬(Eriocheir), 是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品。研究表明, 中華絨螯蟹體內(nèi)有一定量的重金屬富集, 且具有性別和組織差異性[2,27]。Cd2+會(huì)影響中華絨螯蟹卵黃蛋白的合成, 干擾血淋巴中孕酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化, 進(jìn)而抑制卵巢的發(fā)育[28]。但在重金屬誘導(dǎo)下中華絨螯蟹卵巢是否會(huì)產(chǎn)生氧化損傷? 以及機(jī)體的抗氧化酶和MT將產(chǎn)生怎樣的氧化應(yīng)激反應(yīng)? 針對(duì)這2個(gè)問(wèn)題, 本文用不同濃度的Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹進(jìn)行急性染毒, 研究Cd2+和Hg2+在中華絨螯蟹卵巢中的富集情況以及對(duì)相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響, 闡明Cd2+和Hg2+濃度與中華絨螯蟹卵巢氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的劑量——效應(yīng)關(guān)系, 探討MT和抗氧化酶在Cd2+或Hg2+誘導(dǎo)下可能的氧化應(yīng)激機(jī)理, 為甲殼動(dòng)物的生殖毒理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的二齡雌性中華絨螯蟹成體于2016年11月取自溫州樂(lè)清南塘養(yǎng)殖場(chǎng), 共500多只, 隨機(jī)取100只文蛤, 測(cè)量其大小及重量。其甲殼長(zhǎng)、寬、高分別為(48.83±0.62) mm (44.87—54.02 mm)、(45.32±0.46) mm (43.25—49.14 mm)、(24.78±0.32) mm(22.82—27.10 mm), 體重為(52.61±1.33) g (42.25—67.16 g)。

1.2 染毒處理

根據(jù)Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹的96hLC50分別為40.28和3.64 mg/L[29]的1/64、1/32、1/16、1/8和1/4設(shè)置Cd2+、Hg2+單獨(dú)染毒時(shí)的濃度梯度分別為0.63、1.26、2.52、5.04、10.07 mg/L和0.06、0.11、0.23、0.46、0.91 mg/L, 同時(shí)設(shè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)時(shí)隨機(jī)選取活動(dòng)正常、反應(yīng)靈敏、大小相似的個(gè)體500多只。每組濃度設(shè)3個(gè)平行樣, 每個(gè)平行樣中放30只中華絨螯蟹, 飼養(yǎng)在130 cm×50 cm×60 cm的養(yǎng)殖箱中, 水溫為(22±1)℃, pH為7.8。每隔24h更換相應(yīng)濃度的染毒液, 清除代謝廢物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)期間蟹的活性及急性染毒的效果, 實(shí)驗(yàn)選取染毒時(shí)間為6d,期間不喂食。

1.3 重金屬含量測(cè)定

取染毒6d后的各濃度組和對(duì)照組中華絨螯蟹各5只作為1組, 共3組。用去離子水沖洗干凈后, 活體解剖取出卵巢組織, 分別稱重后放入烘箱烘干至恒重, 稱其干重。準(zhǔn)確稱取研磨成粉末狀的卵巢組織0.5 g于微波消解罐中, 各加5 mL濃硝酸和2 mL的高氯酸混合均勻、消解, 然后在電熱板上于140—160℃(Cd)或80℃(Hg)趕酸至0.5—1.0 mL。冷卻后將消化液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中, 用少量硝酸溶液(1%)洗滌消解罐2—3次, 合并洗滌液, 用硝酸溶液(1%)定容至刻度, 混勻。用0.22 μm濾膜過(guò)濾, 作為待測(cè)溶液。其中Hg的含量采用原子熒光光譜儀(AFS-930北京吉天儀器有限公司)測(cè)定, Cd含量使用原子吸收光譜儀測(cè)定(AA240Fs, 美國(guó)瓦里安有限公司)。

1.4 MT mRNA表達(dá)量的測(cè)定

根據(jù)UNIQ-10柱式Tizol總RNA抽試劑盒(上海生工)說(shuō)明提取對(duì)照組及各染毒組中華絨螯蟹的卵巢總RNA。RNA的完整性和濃度分別通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和A260/A280值來(lái)檢測(cè)。以中華絨螯蟹卵巢總RNA為模板, 使用Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒制得cDNA樣品。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的中華絨螯蟹金屬硫蛋白MT-1基因序列(GenBank: GU479377), 中華絨螯蟹MT特異性引物設(shè)計(jì)參照Ren等[30], 確定熒光定量目的基因引物為MT-F 5′-GTCATCACAGCAGCCAGC-3′, MT-R 5′-GCATCTCCTTCCCAACG-3′, 內(nèi)參基因引物為β-actin-F 5′-TGCCAGGGTACATTGTGGTA-3′, βactin-R 5′-TGCGTGACATCAAGGAGAAG-3′。使用Roche LC480熒光定量PCR儀(瑞士)和AGoTaq?qPCR Master Mix試劑盒對(duì)卵巢組織中MTmRNA的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。擴(kuò)增程序?yàn)? 預(yù)變性94℃ 5min; 94℃變性30s, 60℃退火15s, 72℃延伸30s, 42個(gè)循環(huán); 采用2-ΔΔCt法計(jì)算出各測(cè)試樣本MTmRNA的相對(duì)表達(dá)量: ΔCt=CtMT-Ctβ-actin, ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組- ΔCt對(duì)照組。

1.5 氧化應(yīng)激生化指標(biāo)測(cè)定

待測(cè)液的制備取染毒6d后的中華絨螯蟹活體, 將其置冰盤內(nèi)解剖, 取出各濃度組的卵巢,5只蟹一組作為酶液制備的材料。取不同濃度組的卵巢濕重約1 g, 加入9倍(w/v)預(yù)冷的生理鹽水, 在冰浴中充分研磨勻漿, 所得勻漿液再置于冷凍離心機(jī)(轉(zhuǎn)速3000 r/min, 溫度0℃)中離心15min, 最后取上清液測(cè)定SOD、CAT、GPx和NOS活性或H2O2、MDA和NO的含量, 酶液保存在-60℃冰箱中, 24h內(nèi)完成測(cè)定。

氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定參考相關(guān)的試劑盒說(shuō)明書(南京建成)對(duì)H2O2、MDA、NO含量及SOD、CAT、GPx、NOS活性進(jìn)行檢測(cè), 每個(gè)指標(biāo)用同一濃度3個(gè)平行組中的蟹各測(cè)一次, 得3組數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定總蛋白測(cè)定用的試劑盒為南京建成生物研究所生產(chǎn), 用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)的測(cè)定方法和酶活力單位定義均參見(jiàn)說(shuō)明書。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,用單因子方差分析(one-way ANOVA,F)和LSD檢驗(yàn)差異顯著性, 使用OriginPro 8.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖形繪制。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P＜0.05即為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鎘、汞在中華絨螯蟹卵巢中的富集量

由表1可知, 在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度和染毒時(shí)間內(nèi),隨著Cd2+和Hg2+染毒濃度的上升, Cd和Hg在中華絨螯蟹卵巢組織中的積累量呈上升趨勢(shì), 具明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。對(duì)照組除與0.63 mg/L Cd2+以及0.06 mg/L Hg2+濃度組無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 與其他濃度組均有顯著差異(P＜0.05)。

表1 中華絨螯蟹卵巢中鎘、汞富集量Tab. 1 Accumulation of Cd2+ and Hg2+ in the ovary of E. sinensis

2.2 Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢抗氧化酶活性的影響

圖1顯示, 隨著Cd2+染毒濃度的上升中華絨螯蟹卵巢中的抗氧化酶活性總體呈先升后降的趨勢(shì),但3種酶活性達(dá)到最大值的濃度不一。SOD活性在5.04 mg/L Cd2+濃度組達(dá)到最大值, 且與對(duì)照組及其他濃度組均有顯著差異(P＜0.05), 對(duì)照組與各濃度組也均有顯著差異(P＜0.05)。CAT酶活性在2.52 mg/L濃度組達(dá)到最大值, 除0.63與1.26 mg/L濃度組無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。GPx活性在1.26濃度組活性最大, 除0.63濃度組與10.07濃度組無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 鎘對(duì)中華絨螯蟹卵巢抗氧化酶活性的影響Fig. 1 The effect of Cd2+ on antioxidant enzyme activities of E.sinensis ovary

隨著Hg2+染毒濃度的升高, 中華絨螯蟹卵巢中抗氧化酶活性總體也呈先升后降的趨勢(shì), 除0與0.46 mg/L Hg2+濃度組的GPx活性無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 3種抗氧化酶的其他各濃度組間均有顯著差異(P＜0.05)(圖2), 但這3種酶活性達(dá)到最大值的濃度不同。SOD在0.46 mg/L濃度組達(dá)到最大,CAT活性在0.23 mg/L濃度組達(dá)到最大, 而GPx活性在0.11 mg/L濃度組達(dá)最大值。

2.3 Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢MT mRNA表達(dá)量的影響

從圖3和圖4可知, 隨著Cd2+及Hg2+染毒濃度的升高,MTmRNA表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)。Cd2+染毒組中對(duì)照組除與0.63 mg/L濃度組無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。Hg2+染毒組中對(duì)照組與各濃度組均有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 汞對(duì)中華絨螯蟹卵巢抗氧化酶活性的影響Fig. 2 The effect of Hg2+ on antioxidant enzyme activities of E.sinensis ovary

圖3 鎘對(duì)中華絨螯蟹卵巢MT mRNA表達(dá)量的影響Fig. 3 The effect of Cd2+ on MT mRNA of E. sinensis ovary

2.4 Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢MDA和H2O2含量的影響

由圖5和圖6可知, MDA和H2O2的含量均與Cd2+和Hg2+染毒濃度呈正相關(guān), 對(duì)照組與各濃度組均有顯著差異(P＜0.05)。

圖4 汞對(duì)中華絨螯蟹MT mRNA表達(dá)量的影響Fig. 4 The effect of Hg2+ on MT mRNA of E. sinensis ovary

圖5 鎘對(duì)中華絨螯蟹卵巢MDA和H2O2含量的影響Fig. 5 The effects of Cd2+ on MDA and H2O2 level of E. sinensis ovary

圖6 汞對(duì)中華絨鰲蟹卵巢MDA和H2O2含量的影響Fig. 6 The effects of Hg2+ on MDA and H2O2 level of E. sinensis ovary

2.5 Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢NO含量和NOS活性的影響

Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢中NO含量的影響由圖7可見(jiàn), 隨著Cd2+染毒濃度的增加, 中華絨螯蟹各處理組卵巢中的NO含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。對(duì)照組與0.63及1.26 mg/L濃度組無(wú)顯著差異,5.04和10.07 mg/L濃度組間無(wú)顯著差異(P＞0.05),2.52 mg/L與所有組間均有顯著差異(P＜0.05)。

隨著Hg2+染毒濃度的增加, 中華絨螯蟹各處理組卵巢中的NO含量呈上升的趨勢(shì)(圖8)。對(duì)照組除與0.06 mg/L濃度組無(wú)顯著差異外(P＞0.05), 其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。

圖7 鎘對(duì)中華絨螯蟹卵巢NO含量的影響Fig. 7 The effect of Cd2+ on NO content of E. sinensis ovary

圖8 汞對(duì)中華絨螯蟹卵巢NO含量的影響Fig. 8 The effect of Hg2+ on NO content of E. sinensis ovary

Cd2+和Hg2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢NOS活性的影響由圖9可見(jiàn), 隨著Cd2+濃度的增加, 中華絨螯蟹各處理組卵巢NOS活力總體呈上升趨勢(shì)。TNOS酶活在對(duì)照組與0.63 mg/L濃度組無(wú)顯著差異、1.26與2.52 mg/L濃度組也無(wú)顯著差異(P＞0.05);5.04及10.07 mg/L濃度組與其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)照組中華絨螯蟹卵巢的iNOS活性與0.63 mg/L濃度組無(wú)顯著差異; 1.26和2.52 mg/L濃度組無(wú)顯著差異; 5.04和10.07 mg/L濃度組也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

隨著Hg2+濃度的增加, 中華絨螯蟹各處理組的卵巢NOS活力呈上升的趨勢(shì)(圖10)。對(duì)照組的TNOS酶活除與0.06 mg/L濃度組無(wú)顯著差異(P＞0.05)外, 與其他各組均有顯著差異(P＜0.05)。0.06 mg/L濃度組的中華絨螯蟹卵巢iNOS活性與對(duì)照組及0.11 mg/L濃度組無(wú)顯著差異; 0.23和0.46 mg/L濃度組的iNOS活性也無(wú)顯著差異(P＞0.05); 0.91 mg/L Hg2+濃度組的iNOS活性達(dá)到最大值, 并與對(duì)照組及其他濃度組均有顯著差異(P＜0.05)。

圖9 鎘對(duì)中華絨螯蟹卵巢NOS活性的影響Fig. 9 The effect of Cd2+ on NOS activity of E. sinensis ovary

圖10 汞對(duì)中華絨螯蟹卵巢NOS活性的影響Fig. 10 The Effect of Hg2+ on NOS activity of E. sinensis ovary

3 討論

3.1 重金屬對(duì)水生動(dòng)物組織的氧化損傷效應(yīng)

鎘、汞等重金屬是一類典型的環(huán)境污染物, 極易在水生動(dòng)物體內(nèi)富集, 從生物大分子(如DNA,RNA, 各種酶)開(kāi)始對(duì)生物體產(chǎn)生影響, 然后逐步在細(xì)胞、器官、個(gè)體、種群和生態(tài)系統(tǒng)各個(gè)水平上反映出來(lái)[5,11,12]。中華絨螯蟹經(jīng)Cd2+或Hg2+染毒6d后, 在卵巢中Cd和Hg的富集量急劇上升, 最高濃度Cd2+(10.07 mg/L)和Hg2+(0.91 mg/L)組的Cd和Hg富集量分別為對(duì)照組的9.07倍和15.69倍(表1),具有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。有研究表明, Cd2+進(jìn)入蟹的主要方式可能為自由擴(kuò)散作用或者借助鈣離子通道[31]; 而蟹對(duì)Hg2+的吸收主要是通過(guò)鰓直接攝取或通過(guò)食物鏈間接獲取[32]。本研究發(fā)現(xiàn)Hg在中華絨螯蟹卵巢中的富集能力比Cd強(qiáng), 這可能是急性染毒后中華絨螯蟹鰓直接攝取Hg的能力遠(yuǎn)比Cd的自由擴(kuò)散能力強(qiáng)。隨著Cd和Hg在中華絨螯蟹卵巢中積累量的不斷增加, 在卵巢中NO、MDA和H2O2的含量也呈逐漸上升(圖5—8), 說(shuō)明細(xì)胞的氧化損傷程度不斷提高, 這主要因?yàn)橹亟饘僭诼殉仓械姆e累誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS), 引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用, 使MDA在機(jī)體內(nèi)的含量不斷增加[6]。而H2O2和NO都是由活性氧前體O-2衍生而來(lái), 其中H2O2是氧的二電子還原產(chǎn)物, NO是氧的三電子還原產(chǎn)物[10,11], 故卵巢中H2O2和NO的含量也不斷增加。類似的研究在雙殼類[5,6,8,12,33,34]、甲殼類[11,20,35,36]和魚類[3,25,37]中均有發(fā)現(xiàn)。Lin等[11]研究發(fā)現(xiàn), 隨著Cd2+染毒濃度的上升, 中華絨螯蟹肝胰腺中的MDA和H2O2含量均呈上升的趨勢(shì)。金芬芬等[38]研究發(fā)現(xiàn), 隨著Cd2+染毒濃度的增加或染毒時(shí)間的延長(zhǎng), 河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺線粒體中的H2O2含量較對(duì)照組明顯增高。Company等[5]報(bào)道了貽貝(Mytilus edulis)暴露在0.9 μmol/L的Cd2+溶液里24h后, 其鰓中MDA含量顯著升高, 具一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。馬京津等[39]認(rèn)為重金屬誘發(fā)的MDA可以影響河南華溪蟹(S.henanense)生殖細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育, 進(jìn)而導(dǎo)致生殖細(xì)胞質(zhì)量下降, 最終影響溪蟹子代的生長(zhǎng)發(fā)育。李靜等[40]發(fā)現(xiàn), 隨著Cd2+濃度的上升長(zhǎng)江華溪蟹(S.yangtsekiense)肝胰腺中NO含量和NOS活性均呈上升的趨勢(shì)。從圖5和圖6也可以看出, 在Cd2+或Hg2+LC50的1/64、1/32、1/16、1/8或1/4的相對(duì)應(yīng)條件下, Hg2+染毒組的MDA和H2O2含量比Cd2+染毒組高, 說(shuō)明Hg2+對(duì)中華絨螯蟹的毒性要比Cd2+強(qiáng), 這與中華絨螯蟹對(duì)Hg的富集能力比Cd強(qiáng)(表2)一致。

3.2 重金屬脅迫下金屬硫蛋白(MT)和抗氧化酶的作用分析

MT是一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白, 被認(rèn)為是體內(nèi)對(duì)羥基自由基最強(qiáng)的清除劑,具有對(duì)重金屬的解毒和對(duì)微量元素代謝的調(diào)節(jié)作用[16,41]。有研究顯示, 重金屬暴露會(huì)誘導(dǎo)水生動(dòng)物機(jī)體內(nèi)MTmRNA的表達(dá)[17—19,42,43]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著中華絨螯蟹卵巢對(duì)Cd或Hg富集量的增加, 與對(duì)照組相比MTmRNA的表達(dá)量呈明顯上升的趨勢(shì)(表1、圖3、圖4), 說(shuō)明MT對(duì)Cd和Hg等非必需金屬有一定的解毒作用, 也說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)染毒范圍內(nèi)中華絨螯蟹卵巢中的Cd和Hg累積量還沒(méi)有達(dá)到MT解毒的閾值。Pan等[17]發(fā)現(xiàn), 在0.025和0.05 mg/L Cd2+暴露3d后, 日本蟳(Charybdis japonica)鰓和肝胰腺中MT均顯著升高, 與暴露時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。Gao等[44]的研究也發(fā)現(xiàn), 隨著Cd2+暴露濃度的升高和染毒時(shí)間的增長(zhǎng), 長(zhǎng)江華溪蟹(S. yangtsekiense)肝胰腺M(fèi)TmRNA的表達(dá)水平均呈上升的趨勢(shì)。這可能因?yàn)樵阪k、汞等重金屬進(jìn)入中華絨螯蟹后結(jié)合到位于金屬硫蛋白上游序列的金屬效應(yīng)元件中, 從而對(duì)MTmRNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

MTmRNA的水平與組織中重金屬積累水平有關(guān), 如果組織中的重金屬積累了超過(guò)了可承受的范圍,MTmRNA的表達(dá)水平就會(huì)受到抑制[17—19]; 多余的重金屬會(huì)與一系列含有巰基、氨基、羧基、磷酰基等活性基團(tuán)的抗氧化酶結(jié)合, 改變其構(gòu)象和活性甚至變性[6,12]。內(nèi)源性抗氧化劑SOD、CAT和GPx是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分[13,14,17,36]。SOD能清除超氧陰離子自由基, 將其歧化為氧氣和過(guò)氧化氫, 被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[15];作為抵御氧化損傷的第二道防線的CAT和GPx能進(jìn)一步將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化成水和氧氣, 保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害[18,45—46]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 隨著Cd2+或Hg2+染毒濃度的增加,SOD、CAT和GPx活性均呈現(xiàn)出“低濃度激活高濃度抑制”的效應(yīng)(圖1、圖2), 說(shuō)明低濃度的Hg2+(≤0.46)和Cd2+(≤5.04)導(dǎo)致中華絨螯蟹體內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生, 機(jī)體為減輕活性氧的氧化損傷而誘導(dǎo)抗氧化酶活性上升, 產(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”。這在其他水生動(dòng)物如雙殼類軟體動(dòng)物[8,12,19,42]、甲殼類動(dòng)物[11,20,46,47]、魚類[3,7,37]中也均有類似的報(bào)道。但隨著Cd2+或Hg2+染毒濃度的升高, 中華絨螯蟹體內(nèi)大量增加的活性氧自由基超過(guò)了生物體的清除能力, 致使組織受到了活性氧的攻擊而產(chǎn)生損傷, 從而使抗氧化酶的活性下降。此外, 過(guò)多的Cd2+或Hg2+可能與SOD活性中心的Cu2+/Zn2+發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)[14,33,46]或與GPx活性中心的半胱氨酸殘基結(jié)合[5,13,15]影響抗氧化酶的空間結(jié)構(gòu)而使酶活性降低。

本研究發(fā)現(xiàn), 在Cd2+或Hg2+LC50的1/64、1/32、1/16、1/8或1/4的相對(duì)應(yīng)條件下, Cd2+組的CAT和GPx酶活性要比Hg2+組的強(qiáng)(圖1、圖2), 同時(shí)MTmRNA的表達(dá)量也是Cd2+組高于Hg2+組(圖3、圖4)。有研究認(rèn)為, Cd2+與MT的絡(luò)合是應(yīng)對(duì)鎘氧化應(yīng)激最有效的保護(hù)措施, 也被認(rèn)為是一種高效的解毒系統(tǒng), 少量Cd2+進(jìn)入機(jī)體后, 誘導(dǎo)MT的合成而轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)[48,49]。Hg2+對(duì)含巰基的分子, 如GSH、MT和半胱氨酸具有很高的親和力, 但Hg2+與MT的親和力低于Cd2+與MT的親和力[50], 故Hg2+組的MTmRNA的表達(dá)量較Cd2+組低(圖3、圖4), 這也是Hg2+染毒組MDA及H2O2的含量比Cd2+染毒組高(圖5、圖6)的原因之一。據(jù)報(bào)道, 一些金屬, 如鎘、鉛和汞, 由于它們具有電子共享親和性, 可以與抗氧化系統(tǒng)的酶形成共價(jià)連接, 使其失活[51]。Cd2+誘導(dǎo)ROS生成的間接機(jī)制是Cd2+在多種細(xì)胞質(zhì)和膜蛋白中取代鐵和銅從而刺激Fenton反應(yīng)[49]。而汞的毒性作用比較復(fù)雜, 如對(duì)特定的酶抑制作用, 金屬離子平衡受損, 或硫醇和硒代謝物的消耗等[52]。汞引起氧化應(yīng)激的確切機(jī)制尚不清楚, 但汞中毒魚體內(nèi)H2O2含量的增加表明過(guò)氧化物酶的抑制作用; 也有可能是汞抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶去除H2O2的能力[3]。這與本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的Hg2+組的CAT和GPx酶活性均較Cd2+組低相一致。

結(jié)合H2O2和MDA含量及SOD、CAT和GPx活性的變化進(jìn)行分析, 在重金屬誘導(dǎo)下SOD先被激活后, 其反應(yīng)產(chǎn)物H2O2含量開(kāi)始增加, 刺激CAT和GPx活性增強(qiáng)以清除H2O2, 但是其清除速度未能趕得上H2O2的產(chǎn)生速度, H2O2開(kāi)始出現(xiàn)積累。但隨著Cd2+或Hg2+染毒濃度或卵巢中Cd和Hg積累量的增加, 抗氧化酶活力出現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì), 機(jī)體清除H2O2的能力降低, 累積更多的H2O2, 而累積的H2O2將會(huì)進(jìn)一步抑制SOD、GPx和CAT的活力。此外, 卵巢中MDA的含量在Cd2+或Hg2+的刺激下較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05), 反映了高濃度Cd2+對(duì)中華絨螯蟹卵巢的損傷, 體內(nèi)自由基未被及時(shí)清除, 致使機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)被ROS攻擊產(chǎn)生大量的MDA并累積。MDA的累積變化趨勢(shì)與H2O2含量的變化保持一致, 呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)。有關(guān)河南華溪蟹(S. henanense)[45,47]、長(zhǎng)江華溪蟹(S. yangtsekiense)[36]、中華絨螯蟹(E. sinensis)[11,53]、鋸緣青蟹(S. serrata)[17]、阿根廷小長(zhǎng)臂蝦(Palaemonetes argentinus)[35]的研究中也均發(fā)現(xiàn), 隨著重金屬濃度的增加或是暴露時(shí)間的延長(zhǎng), 機(jī)體內(nèi)H2O2和MDA的累積也會(huì)逐漸增加, SOD、CAT和GPx活力出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 說(shuō)明重金屬對(duì)甲殼動(dòng)物造成了氧化損傷, 其程度與重金屬濃度和暴露時(shí)間呈正相關(guān)性。