黏著斑激酶抑制劑TAE226對人口腔鱗癌細胞增殖的影響

廖鵬程,劉 萍,曾 琴,鄒湘渝,聶敏海△

(1.西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院口腔科門診,陜西漢中723000;2.西南醫科大學附屬口腔醫院/口頜面修復重建和再生實驗室,四川瀘州 646000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)簡稱口腔鱗癌，是頭頸部最易好發的以影響口腔黏膜襯里上皮為主的惡性腫瘤[1]。在世界上常見的腫瘤致死排行榜中位居第6[2]。在發展中國家，它是第3常見的惡性腫瘤[1]。隨著對口腔鱗癌研究的不斷深入，以及在臨床上治療方法的不斷改進，患者的術后生存率有了一定的改善，但仍在50%左右[3]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種位于細胞內的非受體型酪氨酸激酶[4]。它與細胞的黏附密切相關，同時介導多條信號通路，與腫瘤的預后有著重要關系。 TAE226是一種雙苯胺嘧啶類化合物，已被開發成為一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，具有三磷酸腺苷(ATP)競爭結合性，它的作用靶點為FAK[5]。本實驗采用CCK-8法檢測不同濃度的TAE226干預HSC-3細胞后，對細胞增殖能力的影響。采用流式細胞術檢測其對細胞凋亡和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 人口腔鱗癌HSC-3細胞株由四川大學華西口腔醫學院、口腔疾病研究國家重點實驗室惠贈。DMEM培養液(Hyclone,賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，優質胎牛血清(北京索萊寶生物科技有限公司)，TAE226(Selleck，上海藍木化工有限公司)，DMSO(美國AMRESCO公司)，CCK-8試劑盒(DojinDo，日本同仁化學研究所)，細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 HSC-3細胞株培養于含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養液中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養，定期換液。

1.2.2TAE226配置 TAE226溶解于DMSO中，調整濃度為1 mmol/L,再用培養液配置成1、5、10、20 μmol/L的不同濃度貯存液，將其置于4 ℃冰箱備用，母液放于-80 ℃冰箱中長期保存。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，將細胞懸液接種于96孔板上。設置對照組和實驗組。實驗組每孔加入100 μL細胞懸液，每組設6個復孔，培養24 h，吸去原培養液，對照組每孔加入新鮮培養液，實驗組加入不同濃度的TAE226共100 μL，繼續培養12、24、36、48、60、72 h。待藥物共培養結束后，棄去孔中液體。實驗組、對照組及空白組加入含有10% CCK-8液的新鮮培養液100 μL。于波長450 nm的酶標儀上測光密度(OD)值。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期分布 取對數生長期細胞，調整細胞密度為3×105個/mL，將細胞懸液接種于6孔板中，培養24 h。棄原培養液，對照組每孔加入新鮮培養液2 mL，實驗組每孔加入不同濃度的TAE226 2 mL，將6孔板放入培養箱中繼續培養24 h。取出6孔板，吸除廢液，漂洗2～3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞3～4 min，低速離心收集細胞，加入預冷70%乙醇，4 ℃固定過夜。低速離心，吸除上清液。每孔加入染色緩沖液500 μL，重懸細胞。加入碘化丙啶染色液各孔 25 μL，RNase A 各孔 10 μL，混勻，分散細胞。避光 37 ℃ 溫浴30 min。流式細胞儀在激發波長488 nm 處檢測細胞周期分布。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況 細胞種板和細胞收集同前細胞周期實驗。收集細胞后，PBS液漂洗2～3次，鏡下調整細胞密度為(1～5)×105個/mL。加入500 μL的Binding Buffer，混勻。加入5 μL的Annexin-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫，避光反應5～15 min。于1 h內用流式細胞儀檢測發射波長530 nm、激發波長488 nm下的細胞凋亡率。實驗重復3次。

2 結 果

2.1TAE226對口腔鱗癌HSC-3細胞增殖的抑制作用 當TAE226的濃度為1 μmol/L，在12 h時與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但是隨著時間的延長，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著TAE226的濃度增至5、10、20 μmol/L時，在同一濃度下，隨著作用時間的延長，其對HSC-3細胞增殖的抑制作用逐漸增強；同一時間下，隨著TAE226濃度的增加，TAE226對細胞增殖的抑制作用逐漸增強(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 不同濃度的TAE226于不同時間下HSC-3細胞的OD值

圖1 不同濃度的TAE226于不同時間下HSC-3細胞的OD值

2.2TAE226對口腔鱗癌HSC-3細胞凋亡的影響 在TAE226作用于HSC-3細胞24 h后，TAE226濃度為1、5、10、20 μmol/L的實驗組凋亡率分別為1.59%、8.50%、28.47%、49.05%。與對照組的0.08%相比，差異有統計學意義(P<0.05)，隨著TAE226濃度的不斷增高，其對HSC-3的促凋亡作用越明顯，見圖2。

2.3TAE226對口腔鱗癌HSC-3細胞周期的影響 在細胞周期各階段，對照組與1 μmol/L TAE226實驗組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。而對照組與其余各實驗組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。在G1期和S期比較時發現10 μmol/L和20 μmol/L實驗組差異無統計學意義(P>0.05)。當TAE226的濃度達到5 μmol/L時，細胞周期G1期和S期所占比例逐漸降低，而G2期所占比例逐漸升高。組間比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖3。

A:對照組；B：TAE226濃度為1 μmol/L實驗組；C：TAE226濃度為5 μmol/L實驗組；D：TAE226濃度為10 μmol/L實驗組；E：TAE226濃度20 μmol/L實驗組

圖2 不同濃度的TAE226對HSC-3細胞凋亡的影響

A:對照組；B：TAE226濃度為1 μmol/L實驗組；C：TAE226濃度為5 μmol/L實驗組；D：TAE226濃度為10 μmol/L實驗組；E：20 μmol/L實驗組

圖3 TAE226對HSC-3細胞周期的影響

3 討 論

口腔鱗癌是頭頸部最易好發的惡性腫瘤，全世界每年有65萬以上的人被診斷為口腔鱗癌，同時每年約有35萬的人死于口腔鱗癌[6]，近年來隨著人們生活環境和生活方式的改變，口腔鱗癌的發生趨于年輕化。在過去的十年里，口腔鱗癌的發病率有所下降，但近20年來患者的5年生存率僅有約5%的提升，生存率的上升基本處于停滯狀態[7]。越來越多的學者將目光集中于高效藥物和早期診斷的靈敏指標的尋找。

FAK在不同來源的腫瘤細胞中隨著腫瘤的分化程度及轉移狀態的不同，它的核酸和蛋白的表達量也不盡相同，但目前多認為在惡性程度高的腫瘤或者已經發生了轉移的腫瘤組織中，FAK的表達有顯著的提高。在惡性腫瘤的早期事件中可以發現FAK的過表達，并且這種現象會持續存在[8]。WANG等[2]通過對108例口腔鱗狀細胞癌患者的病變組織和正常組織的比較研究中發現，miR-433可通過ERK/MAPK信號通路來下調FAK，從而抑制SCC-9細胞增殖、遷移、侵襲。CHANG等[9]通過提高生長緩慢時期的SCC-25細胞的FAK表達量，可以促進導致雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERA)的磷酸化、轉錄活性和細胞生長速率的增加。實驗中通過降低生長快速時期的SCC-25中FAK表達量，可以降低ERA的磷酸化和細胞的活性，抑制細胞的生長。由此說明口腔鱗癌的活性可被FAK/AKT信號增強，這也是其促進細胞生長的關鍵[9]。CHIU等[10]研究發現相比于侵襲性低的SCC-4細胞，侵襲性強的OECM-1細胞的FAK和pY397高表達，同時與GDP相關聯的Rac-1也高表達。當沉默OECM-1細胞中的FAK，Rac-1表達量明顯降低，而這一變化也使得細胞的侵襲性降低，由此說明了抑制FAK在Py397位點的磷酸化或降低Rac-1的活性，可作為治療轉移性口腔鱗狀細胞癌的一種治療策略。本項研究旨在探索FAK的抑制劑TAE226對口腔鱗癌細胞的相關作用，以期尋找出合適的高效治療藥物。

TAE226可通過阻斷FAK與ATP的連接位點及FAK的Y397位點和Y861位點的自磷酸化，從而抑制FAK的活性[11]。BEIERLE等[12]研究得出用TAE226處理了人神經母細胞瘤細胞后，FAK磷酸化水平呈濃度依賴性下降，細胞活力下降，細胞周期阻滯，細胞的凋亡增加。

本實驗中的研究發現TAE226可以有效地抑制細胞增殖，在濃度為1 μmol/L時效果并不明顯，但是隨著濃度的不斷增加，抑制效果越來越強。這與文獻[2,9]結果相一致。同時TAE226可以促進細胞凋亡事件的發生，而這與其影響了細胞周期的關系密不可分，在細胞周期實驗中發現，TAE226將HSC-3細胞阻滯于G2期，這與BEIERLE等[12]的研究相吻合。處于G2期的細胞已經完成了DNA的復制，處于相關蛋白的形成階段及細胞的有絲分裂階段，由此可以看出TAE226的作用位點主要與蛋白及RNA相關，同時也再次驗證了上述增殖實驗的結果，這也為后續的研究提供了一定的依據。

本實驗證實了TAE226可以抑制口腔鱗癌細胞HSC-3細胞株的增殖，促進細胞的凋亡，同時將細胞阻滯于G2期，導致細胞的活力下降。以上結論可為口腔鱗癌的機制研究提供一定的理論依據。但是其對蛋白分子水平和RNA等基因水平的具體影響和機理還未可知，需要進一步的研究。