miR-578表達上調對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響及其與PREX2a的相關性分析

張 祥，王壘壘，姚俊朝，趙永輝，李賀揚，劉旭光，龍銀波，劉 晨，王 鵬

(河北省滄州市中心醫院神經外科 061000)

微RNA(microRNA，miRNA)是一種長17～25個核苷酸的單鏈內源性的非編碼RNA,其可通過與靶基因的3′UTR區互補配對，指導miRNP復合體對靶基因mRNA進行切割或者翻譯抑制；也可以通過類似siRNA的RNA干擾途徑，對基因表達進行抑制性調控[1-2]。它們在許多正常生物學行為如細胞生長、增殖及凋亡等過程中發揮重要作用[3]。研究發現，miR-578在BRCA1/2相關乳腺癌中表達下調且可影響血管內皮生長因子、黏著斑激酶及缺氧誘導因子等信號通路[4]。PREX2a作為一種腫瘤相關蛋白，通過抑制同源性磷酸酶-張力蛋白活性在包括腦膠質瘤等多種惡性腫瘤的發生、發展中發揮生物學活性[5]。膠質瘤作為顱內最常見惡性腫瘤以無限增殖及向周圍正常腦組織浸潤而著稱，而miR-578在其發生、發展中所發揮的作用仍未有報道，本研究旨在探討miR-578對腦膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質瘤組織及正常腦組織分別取自滄州市中心醫院神經外科腦膠質瘤及癲癇手術治療患者，其中正常腦組織8例，不同級別的腦膠質瘤組織56例，其中Ⅱ級18例、Ⅲ級15例、Ⅳ級23例。人膠質瘤U87、U251細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，由滄州市中心醫院神經病學研究所凍存。miR-578類似物序列(5′-AAT GCT ATT ATA AAC CCA TT-3′)及陰性對照序列(5′-ACT ACC GTT GTT ATA GGT G-3′)由廣州瑞博生物公司合成。Trizol試劑購自美國英杰公司，用于實施qPCR的miR-578定量試劑盒購自上海吉瑪公司，GAPDH單抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，小牛血清和DMEM培養液購自美國Gibco公司，脂質體Lipofetmiane2000購自美國Invitrogen公司，膜聯蛋白v-fitc凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，PREX2a(miR-578的直接作用底物)抗體購自美國Abzoom公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 膠質瘤細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養液置于37 ℃ 5% CO2相對濕度條件下的培養箱中培養，轉染時將2×105個U87、U251接種在6孔板內，待50%～80%細胞融合后，經Lipofectamine2000介導將miR-578類似物和陰性序列分別轉染到上述膠質瘤細胞中。轉染后6 h更換完全培養液繼續培養48 h，收集細胞用于實驗研究。

1.2.2qPCR 采用Trizol法提取腦膠質瘤組織與正常對照腦組織標本中總RNA，轉染后48 h的miR-578類似物和陰性序列組U87、U251細胞總RNA。分別用miR-578和U6引物于熒光定量PCR儀(美國，7500型ABI)進行Real-time PCR擴增，以U6作內參。選用20 μL擴增體系，反應條件：95 ℃ 3 min循環1次；95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s，循環40次，每2秒升高0.2 ℃，循環1次。按相對表達倍數=2-(△Ct目的RNA-△Ct內參RNA)計算各組織及細胞中miR-578和內參U6的相對表達量。

1.2.3Western blot U87、U251細胞轉染后繼續培養48 h，提取總蛋白。取150 g上樣量，100 g/L十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質，電轉移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。0.05 g/mL脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人PREX2a一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，加入小鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h。結果采用凝膠成像分析系統掃描。

1.2.4噻唑藍(MTT)法 每組細胞按2×103個細胞(每孔200 mL)接種到96孔板，分別于接種后24、48、72 h每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37 ℃條件下繼續培養4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 mL，振蕩15 min，紫外分光光度計570 nm波長測各孔吸光度值，每組設6個復孔。

1.2.5細胞平板克隆形成實驗 轉染后48 h，制備單細胞懸液，計數，取2×103個細胞接種于60 mm的培養皿中。培養2周后，棄去培養液，PBS輕洗2次，甲醇固定15 min，0.5%的結晶紫染色，顯微鏡下觀察，計數細胞克隆?？寺⌒纬陕?(克隆形成數/接種細胞數)×100%。

1.2.6流式細胞術 轉染后48 h用胰酶消化成單細胞懸液，收集至1.5 mL EP管中，PBS(0.01 mol/L，pH7.2)洗滌細胞2次，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min,收集細胞，75%乙醇1 mL、4 ℃固定18 h以上。200 μL RNAase(1 mg/mL)、37 ℃孵育30 min，800 μL碘化丙啶(PI)染色液混勻后4 ℃避光染色30 min，應用FACS Calibur(美國BD公司)流式細胞儀在488 nm檢測。

2 結 果

2.1不同組織中miR-578表達情況 qPCR結果顯示，WHOⅣ級膠質瘤組織中miR-578表達水平為(18.20±2.53)%，WHOⅢ級膠質瘤組織中miR-578表達水平為(36.20±3.34)%，WHOⅡ級膠質瘤組織中miR-578表達水平為(51.40±4.30)%；正常腦組織中miR-578表達水平為(59.60±4.31)%。miR-578表達與膠質瘤級別呈負相關(r=0.912，P=0.00)；膠質瘤組織中miR-578水平較正常腦組織明顯降低(P<0.01)，見圖1。

圖1 qPCR膠質瘤和正常腦組織中miR-578表達情況

2.2膠質瘤細胞中miR-578、PREX2a表達情況 各細胞組的qPCR檢測到miR-578類似物組miR-578水平較轉入陰性序列組明顯升高(P<0.05)，見圖2；Western Blot檢測到各細胞組的miR-578類似物組miR-578的直接作用底物PREX2a表達較陰性序列組明顯下降(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 膠質瘤細胞miR-578相對表達情況

圖3 膠質瘤細胞PREX2a表達情況

圖4 U87膠質瘤細胞生存能力情況

圖5 U251膠質瘤細胞生存能力情況

A:U87細胞陰性序列組；B：U87細胞miR-578類似物組;C:U251細胞陰性序列組；D:U251細胞miR-578類似物組

圖6 膠質瘤細胞細胞克隆形成率情況

圖7 膠質瘤細胞凋亡情況

2.2轉入miR-578類似物后對膠質瘤細胞增殖能力的影響 與轉入陰性序列組比，U87細胞系的miR-578類似物組膠質瘤細胞在24、48、72 h的增殖率分別為(81.65±4.03)%、(68.38±3.67)%、(53.67±3.28)%，U251膠質瘤細胞在3個時間點的增殖率則分別為(79.67±3.06)%、(61.87±4.66)%、(45.39±2.84)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

2.3細胞平板克隆形成實驗 與陰性序列組比較，轉入miR-578類似物組U87細胞克隆形成率為(37.67±2.89)%、U251細胞為(34.67±3.26)%，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

2.4流式細胞技術檢測情況 與陰性序列組比較，U87、U251膠質瘤細胞的miR-578類似物組凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖7。

3 討 論

惡性膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，屬人類預后極差的腫瘤之一[6-7]。隨著多模態三維影像融合與神經導航、神經電生理監測與喚醒手術、術中實時成像等技術在臨床中逐步應用；替莫唑胺(temozolomide,TMZ)聯合常規分割適形外照射的同步放化療及TMZ序貫化療成為惡性腦膠質瘤的標準治療方案；惡性腦膠質瘤局部治療的手段逐漸豐富，包括卡莫司汀緩釋膜片及對流增強的局部化療，推高了惡性腦膠質瘤的局部化療藥物濃度，使得腦膠質瘤治療方法逐步增多，但其中位生存期仍不足18個月[8-10]。因此如何控制腦膠質瘤細胞增殖及遷移成為其治療的重要研究方向。

miRNA作為與正常及病理情況下細胞增殖、運動等生物學特性密切相關的內源性非編碼RNA成為近年研究的重點[11]。研究發現，眾多miRNA在膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲及腫瘤細胞表型轉化中發揮重要作用，如miR-451在膠質瘤細胞增殖-遷移表型轉換中發揮重要作用；miR29C、miR134等與膠質瘤細胞增殖密切相關。研究表明，PREX2a作為一種鳥氨酸交換因子(GEF)，其通過促進腫瘤血管生成促進多種惡性腫瘤的轉移且在膠質瘤表型轉換中發揮重要作用，提示可能參與惡性腫瘤的發生和發展[12-13]。

本研究Western Blot結果顯示，miR-578在正常腦組織中較腦膠質瘤組織中表達明顯升高,且與腦膠質瘤級別呈負相關。qPCR檢測結果顯示：膠質瘤細胞中miR-578水平明顯較正常腦組織降低，表明其在膠質瘤細胞中表達降低。轉入miR-578類似物后膠質瘤細胞中miR-578水平明顯升高，PREX2a明顯下降。miR-578過表達的膠質瘤細胞增殖活性明顯下降，表明miR-578在膠質瘤細胞增殖中起到負性調控作用。流式細胞技術檢測膠質瘤細胞凋亡結果顯示轉入外源性miR-578類似物后，膠質瘤細胞更容易凋亡，表明miRNA-578表達低的膠質瘤細胞生存能力更強。

內含子中編碼的miRNA作為一種細胞內生因子，對細胞生物學過程的調節比轉錄調節效果更快并且是可逆的[14]。以上研究結果表明，膠質瘤細胞中下調的miR-578可促進細胞增殖及增強膠質瘤細胞的生存能力，其機制可能與調節PREX2a相關。提示miR-578可作為對膠質瘤復發、轉移及預后的預測指標，同時也為人腦膠質瘤治療提供了新的思路。