HO-1對膿毒癥大鼠血漿中HMGB-1表達的影響及其心肌保護機制

周儀華,袁 影,盛志勇,王 舒,王 萌,郭良云

(南昌大學第二附屬醫院：1.重癥醫學科；2.超聲科,南昌 330006)

膿毒癥性心肌損傷是膿毒癥休克難以糾正，導致患者最終死亡的重要原因，血紅素氧合酶-1(HO-1)對膿毒癥心肌損傷具有保護作用[1]。經脂多糖(LPS)刺激后，有活力的心肌細胞通過TLR4/p13kγ信號通路分泌高遷移率族蛋白B-1(HMGB-1)，HMGB-1在LPS誘導的心臟收縮功能障礙中發揮重要作用[2]。在肺部、腸道等器官功能炎癥損傷動物模型中，機體通過調節 HO-1及HMGB-1的釋放而發揮器官功能的保護作用[3-4]。HO-1的心肌保護作用是否與HMGB-1的表達存在特定關系仍然不清楚。本研究通過盲腸結扎穿孔術(CLP)方法建立膿毒癥大鼠心肌損傷模型，給予HO-1增強劑和抑制劑，檢測膿毒癥大鼠血漿中心肌損傷標志物和HMGB-1的表達，明確HO-1與HMGB-1是否存在特定關系，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD雄性大鼠128只(南昌大學江西醫學院動物科學部提供)，體質量180～220 g。

1.2方法

1.2.1模型的建立 所有大鼠術前禁食12 h，采用異氟烷吸入麻醉法誘導和維持大鼠麻醉狀態，用手術直剪于腹白線中點下方約0.3 cm處逐層剪開皮膚、肌層和腹膜，直視下探查腹腔，將盲腸末端取出并置于腹壁外，采用4號縫合線距盲腸末端1.6 cm 處結扎，結扎后用3號三棱針穿刺1孔，之后分別將盲腸回納腹腔，4號縫合針逐層縫合關腹。術后3 h左右自由進食、飲水。觀察大鼠活動、進食、豎毛、腹瀉、眼球凹陷、呼吸等情況。

1.2.2實驗分組 SPF級SD雄性大鼠128只，隨機分為4組：假手術組、膿毒癥組、鈷原卟啉(Copp)Ⅸ組、鋅原足啉(Znpp)Ⅸ組，每組32只。假手術組除不做CLP術外，其余操作均同膿毒癥組；CoppⅨ組和ZnppⅨ組分別提前24 h給于HO-1增強劑CoppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)和抑制劑ZnppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)，以同樣方法制作膿毒癥模型。

1.2.3主要試劑及觀察指標 HO-1增強劑CoppⅨ(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，HO-1抑制劑ZnppⅨ(美國Sigma公司)，10%水合氯醛溶液(上海強順化工有限公司)，10%甲醛溶液(西隴化工股份有限公司)，HMGBl和HO-1抗體及相關二抗(美國Cell Signaling公司)。各組均于0、6、12、24 h處死大鼠8只，開腹經腹主動脈抽取全血5～6 mL,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組血漿中CK-MB、cTnⅠ、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、HMGB-1水平，按試劑盒(美國Amersham公司)說明書進行操作。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織結構變化 取心臟組織，以10%甲醛溶液固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，超薄切片機切片，切片厚度5 μm，行常規HE染色。石蠟切片常規脫蠟水化，蘇木素液染色，1%鹽酸乙醇分化，返藍，乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封片，選擇橫斷心肌的切片放大200倍，顯微鏡下觀察心肌組織病理結構變化情況。

1.2.5Western Blot檢測HMGB-1和HO-1蛋白表達 提取心肌細胞總蛋白，取25 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉，加入HMGB-1兔抗人單克隆抗體(1∶1 000)孵育,洗脫后加入辣根過氧化氫酶標記的二抗進行孵育，通過化學發光法檢測蛋白條帶,充分洗脫后添加顯影液孵育，并于暗室中曝光。同樣方法檢測心肌細胞HO-1蛋白表達。

2 結 果

2.1術后各組實驗動物一般情況觀察 所有實驗動物術后均很快蘇醒，各組均出現心率、呼吸加快，精神反應差，部分呈嗜睡狀態，飲食差，豎毛，腹瀉等狀態，少數出現出血或出血傾向。假手術組術后3 h左右恢復正?；顒印⑦M食、進水。膿毒癥組在24 h死亡1只，ZnppⅨ組24 h死亡2只。

表1 各時間點血清H-FABP、HMGB-1及HO-1水平

續表1 各時間點血清H-FABP、HMGB-1以及HO-1水平

a：P<0.05，與膿毒癥組同時間點比較；b：P<0.01，與CoppⅨ組同時間點相比較；c：P<0.05，與CoppⅨ組同時間點相比較；d：P<0.05，與膿毒癥組同時間點比較；e：P<0.01，與CoppⅨ組同時間點相比較

2.2各時間點血漿CK-MB、cTnⅠ、H-FABP及HMGB-1表達水平變化 膿毒癥組和ZnppⅨ組CK-MB、cTnⅠ升高，CoppⅨ組短暫升高后呈下降趨勢，與膿毒癥組和CoppⅨ組相比，ZnppⅨ組CK-MB、cTnⅠ升高明顯(P<0.05)。除假手術組外，其余各組H-FABP均在6 h內升高，6 h后開始下降，與CoppⅨ 組相比，ZnppⅨ組升高明顯(P<0.05)。假手術組HMGB-1表達水平無明顯變化，其余各組HMGB-1表達水平均升高，其中ZnppⅨ組升高最明顯，與膿毒癥組和CoppⅨ 組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3HE染色法觀察心肌組織結構變化 光鏡下觀察大鼠心臟的形態學變化：假手術組心肌結構清晰，胞核完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，結構正常；膿毒癥組可見心肌細胞水腫顯著，核溶解、壞死；CoppⅨ組細胞腫脹、心肌纖維排列尚整齊，胞核完整，未見核溶解、壞死；ZnppⅨ組可見明顯細胞腫脹，心肌纖維排列紊亂，核溶解壞死。見圖1。

圖1 HE染色光鏡下心肌組織結構變化(×200)

2.4Western Blot檢測心肌細胞HMGB-1及HO-1蛋白的表達 假手術組HMGB-1和HO-1蛋白的表達較弱，其余3組HMGB-1和HO-1蛋白均有不同程度的表達，其中ZnppⅨ組HMGB-1蛋白的表達最顯著，與膿毒癥組和CoppⅨ組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.01)。CoppⅨ組HO-1蛋白的表達最顯著，與膿毒癥組和ZnppⅨ組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A:假手術組；B:膿毒癥組；C:CoppⅨ組；D:ZnppⅨ組

圖2 心肌細胞HMGB-1及HO-1蛋白的表達

3 討 論

膿毒癥時產生的多種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6等，這些炎癥因子可直接或間接損害心肌。這些細胞因子相互作用，可形成許多正反饋環，導致炎性反應持續加重，不僅可直接抑制心肌收縮功能，還參與心肌組織結構的破壞，增加心臟前負荷，破壞心肌鈣穩態。HMGB-1是相對于TNF-α、IL-1等新的“晚期”炎癥因子，是膿毒癥致死效應的關鍵炎癥介質，其表達水平與膿毒癥嚴重程度及預后高度相關[1]。H-FABP主要存在心肌細胞胞質中，血液和其他組織中水平極低，因此在診斷心肌損傷方面具有較高的特異性；有研究顯示，當心肌受損時參與心肌脂肪酸的攝入、運輸和代謝的H-FABP會在心肌損傷時穿過細胞膜漏入血液中[5]。由于其相對分子質量小，在心肌受損情況下，可迅速穿過細胞膜漏入血管內，這在診斷心肌損傷方面具有較高的敏感性[6]。本研究通過CLP方法建立膿毒癥大鼠模型，給予HO-1增強劑和抑制劑，檢測膿毒癥大鼠血漿中心肌損傷標志物和HMGB-1的表達。表1可以看出，假手術組各個時間點血漿中CK-MB、cTnⅠ、H-FABP無明顯變化，而其余3組各指標在實驗6 h內均有不同程度升高，從一定程度上證實膿毒癥大鼠心肌損傷動物模型造模成功。

HO-1是一種細胞保護性蛋白，在炎性反應過程中可以抵抗各種有害刺激導致的機體損傷。目前已證實，在膿毒癥心肌、肝臟、肺部等疾病的靶器官保護方面發揮重要作用[7-9]。從表1可以看出，ZnppⅨ組血漿中各心肌損傷標志物CK-MB、cTnⅠ、H-FABP均較CoppⅨ組明顯升高，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。因為CoppⅨ是HO-1增強劑，而ZnppⅨ是HO-1抑制劑,因此，筆者推測在實驗過程中CoppⅨ通過刺激HO-1的生成而發揮膿毒癥心肌損傷的保護作用，這與上述多數研究所述的HO-1具有器官保護功能基本一致。同樣，表1提示HMGB-1因子在ZnppⅨ組升高最明顯，而在CoppⅨ 組的表達雖有升高，但明顯低于CoppⅨ組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。筆者推測在膿毒癥心肌損傷動物模型中，HO-1與HMGB-1之間可能有某種特定的關聯。

本研究結果表明，假手術組大鼠心臟組織細胞結構完整，未見明顯心肌損傷，ZnppⅨ組心臟組織細胞嚴重破壞，膿毒癥組次之，而CoppⅨ組心肌損傷明顯較ZnppⅨ組和膿毒癥組減輕，從心臟組織病理學角度證實在膿毒癥心肌損傷過程中HO-1發揮著心臟保護作用。

另外，通過Western Blot方法檢測損傷心肌HMGB-1及HO-1的表達，從細胞的角度探討HMGB-1及HO-1在膿毒癥心肌損傷過程中發揮的作用以及它們之間可能存在的關系。圖2結果表明，假手術組HMGB-1和HO-1蛋白的表達均較弱，其余3組蛋白表達均有不同程度的增加。其中ZnppⅨ組HMGB-1蛋白的表達最顯著，而CoppⅨ組該蛋白表達最弱，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)；CoppⅨ組HO-1蛋白的表達最顯著，而ZnppⅨ組該蛋白表達最弱，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

LI等[3]的研究發現在小鼠模型中氫氣可以通過上調HO-1的合成抑制HMGB-1的表達，改善肺組織的炎性反應，并改善模型動物的死亡率。YU等[4]建立膿毒癥大鼠腸功能損傷模型，給予氫氣進行干預，研究發現，H2對野生型嚴重膿毒癥大鼠腸功能損傷具有保護作用，其機制是通過調節 HO-1及HMGB-1的釋放，減少氧化應激及炎癥損傷，增加存活率。KIM等[10]的研究也證實在巨噬細胞系RAW264.7細胞中甘草皂苷可以通過上調H0-1的合成抑制LPS誘導的HMGB-1的表達。

本研究發現，HO-1和HMGB-1可能存在特定關系，即HO-1升高HMGB-1即下降，而HO-1下降，HMGB-1即明顯升高。因此，筆者推測，HO-1可能通過抑制HMGB-1的表達而發揮膿毒癥心肌保護作用。