南繁區玉米彎孢霉葉斑病菌的鑒定及其生物學特性研究①

鄭肖蘭 鄭行愷 趙 爽 鄭 浩 陸翠梅 蔡秀清 ③

(1中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 海南?？?571101；2海南大學熱帶農林學院 海南?？?570228；3農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室 海南?？?571101；4海南省熱帶農業有害生物監測與控制重點實驗室 海南?？?571101)

玉米(Zea mays L.)為禾本科玉米屬一年生草本植物[1]，經濟價值很高，既可作糧食，也可用作工業原料和飼料。據考證，玉米栽培歷史已有七千多年，是全世界分布最廣種植最多的糧食作物之一。隨著社會經濟的發展，全球玉米的需求量均持續增長，是種植面積和產量增長最快的主要糧食品種之一。在中國的播種面積位居第三，僅次于谷類作物小麥和水稻，在世界上僅次于美國[2]。全世界主要在熱帶和溫帶地區種植廣泛，海南因可播種冬玉米而成為中國玉米重要的南繁育種基地。因此，玉米在中國經濟發展中占有重要地位，必須把保障玉米生產安全作為重中之重。作為中國第三大糧食作物，病蟲害問題一直都是玉米穩產、高產的限制因素，而玉米彎孢霉葉斑病是海南省南繁種植區最嚴重的玉米葉部病害之一。據研究資料，在生產上，玉米因病害造成的損失可達6%～10%，嚴重時達到30%以上[3]。中國玉米病害主要有30余種，按其侵染類別可分為寄生性病害和非寄生性病害2類。玉米寄生性病害有小斑病、大斑病、莖腐病、枯萎病、矮花葉病毒病、根結線蟲、根腐線蟲病等。不適宜的生長條件都可能導致非寄生性病害的發生[2]。通過對玉米病害進行調查發現，由Curvularia lunata Boedijn引起的玉米彎孢霉葉斑病是夏玉米的主要病害，該病主要發生在熱帶及亞熱帶地區。據報道，在中國，彎孢霉葉斑病最早發生于水稻、高粱等作物[4]。自 1956年 Nel-son首次報道由彎孢霉菌引起玉米葉斑病，相繼在美國、南斯拉夫、意大利、巴西、泰國、印度等國外玉米栽培區流行，并造成重大損失[5]。20世紀80年代初，在中國山東沿海地區曾有關于玉米彎孢菌葉斑病的報道，但未能確定其病原菌種類。1994年北京夏玉米重度發生了玉米彎孢菌葉斑病，發病率達60%。90年代中后期，在中國華北、東北玉米主產區該病發病較嚴重，群眾開始稱這種病害為黃斑病，通過對黃斑病病原進行研究發現，黃斑病的病原為新月彎孢霉[6]。

2010年玉米彎孢霉葉斑病在鄭州市中度偏輕發生，局部中偏重發生，發生面積達 2.93萬hm2，占玉米種植面積的19.2%，較往年重，發生盛期最高病株率、病葉率均達100%[7]。由于耕作制度的變更、品種的更換及全球氣候變暖等原因，玉米彎孢菌葉斑病已成為嚴重危害玉米的重要病害之一[8]。目前國外學者的研究主要集中在病害造成的損失、玉米品種抗病性、彎孢菌生物學和致病作用及病害發生規律等方面的研究。趙來順等[9]根據病斑的大小、顏色、形狀以及產孢狀況等特征，將玉米彎孢菌葉斑病的癥狀類型分成抗病型(R)、中間型(M)和感病型(S)3種。目前，從中國該病發生及危害的情況來看，重點防治對象為新月彎孢氣生變種，即其優勢致病菌。據Marci等[10]報道，該變種產生的毒素屬于非寄主專化性毒素。呂國忠[11]、趙來順等[9]也報道，玉米彎孢菌可以產生毒素，且毒素對寄主種子的萌發及胚根和胚芽生長都有抑制作用，可使幼苗枯死。

以往的研究區域均屬于溫帶亞熱帶地區，而且都是針對玉米病蟲害進行調查和病原的生物學特性及防治方法進行研究，而關于南方繁殖育種區玉米病害的相關研究尚未見報道。本研究特對熱帶地區海南南繁種植區玉米病蟲害進行調查，期間筆者團隊發現玉米彎孢霉葉斑病普遍發生。鑒于與以往報道該病害的地域差異大，促使筆者通過柯赫氏法則、生長速率測定法和血球計數板計數法等對此病害進行生物學特性方面的研究，為南繁區玉米彎孢霉葉斑病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

玉米彎孢霉葉斑病葉片，采集于三亞南濱農場南繁玉米種植基地。

1.1.2 供試菌

玉米彎孢霉葉斑病病菌C24，由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離純化保存。

1.1.3 供試培養基

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA+玉米綠葉煎汁、燕麥。

1.1.4 供試試劑

瓊脂，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，乳糖，D-果糖，D-木糖，可溶性淀粉，L-絲氨酸，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-賴氨酸，L-亮氨酸， L-纈氨酸，L-脯氨酸， 甘氨酸，蘇氨酸， CaCO3，MgSO4·H2O，K2HPO4， KCl， NaNO3， FeSO4·7H2O， 四環素， 鏈霉素，HCl，NaOH等。

1.1.5 儀器設備

培養皿，錐形瓶，打孔器，酒精燈，超凈工作臺，顯微鏡，恒溫培養箱，高壓蒸汽滅菌鍋，鑷子，電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA＋玉米綠葉煎汁、燕麥培養基成分及制備方法參考鄭肖蘭方法[12]。

各種培養基如果需要加入抗生素，則待培養基冷卻至40～60℃，加入四環素(Tetracycline，Tet)50 μg/mL、 鏈霉素(Streptomycin， Str)100 μg/mL，搖勻倒平板備用。

1.2.2 樣本采集、處理及分離培養

從三亞市南濱農場南繁玉米種植基地采集玉米彎孢霉葉斑病病葉，分裝于封口樣品袋中帶回實驗室進行保濕、鏡檢和分離培養等處理。參考鄭肖蘭等[13]分離方法，待長出菌落后移植到PDA平板上純化、編號、保存，待鑒定。

1.2.3 病原菌的單孢分離

參照鄭肖蘭等[13]分離方法，使用滅菌牙簽挑取含單孢的瓊脂塊放入PDA平板培養基，28℃下培養5d。

1.2.4 病原菌鑒定

(1)病原菌的形態特征觀察和分離菌的驗證參照鄭肖蘭等方法[12]；(2)真菌ITS保守序列擴增采用真菌ITS區段的通用引物 ITS1和ITS4；C24菌絲體收集及基因組提取、PCR擴增反應體系和擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測及后續的測序分析均參考鄭肖蘭等[14]方法。

1.2.5 病原菌生物學特性研究

下列研究均參照鄭肖蘭等方法[12]。

(1)培養基對C24菌絲生長影響測定；

(2)不同溫度對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(3)不同pH值對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(4)不同碳源對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(5)不同氮源對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(6)光照對參試菌C24菌絲生長影響測定。

1.2.6 病原菌孢子形態觀察 取菌株C24菌餅接種至100 mL的PDB液體培養基(成分除不添加瓊脂外其余與PDA相同)中，在28℃下150 r/min振蕩培養4 d，觀察孢子形態及大小。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

田間調查發現玉米彎孢菌主要侵染玉米葉片，也可危害玉米葉鞘和苞葉。初生褪綠小斑點，逐漸擴展為圓形至橢圓形褪綠透明斑，病斑中間呈枯白色或黃褐色，四周有半透明淺黃色暈圈，邊緣有較細的褐色環帶，一般大小(0.5～4.0)×(0.5～2.0)mm，大的可達7.0×4.0 mm(圖1)。濕度大時，病斑在玉米葉片正、反面均可產生灰黑色霉狀物，即病原菌的分生孢子和分生孢子梗。發病嚴重時，病斑密布整片葉片，形成大面積壞死，直至整個葉片干枯死亡。

2.2 病原菌C24的形態學鑒定

圖1 玉米彎孢霉葉斑病的癥狀

玉米彎孢菌C24在PDA培養基上菌落初始為灰白色，但隨著菌落培養時間增加，分生孢子梗呈淡褐色至深褐色，有橫隔，較直，孢痕明顯 （圖2）。分生孢子呈黑褐色，橢圓形或梭形，一般有3個隔膜，兩端細胞鈍圓，顏色較淡且稍小，而中部2個細胞顏色最深且較大(圖3)。

圖2 PDA培養基上菌株C24的菌落形態

圖3 菌株C24的分生孢子形態

2.3 病原菌對玉米葉片的致病性

玉米葉片接種菌株C24后，第3天葉片產生病斑(圖4)，病斑中間黃褐色，四周有半透明淺黃色暈圈，產生灰黑色霉狀物。經比較可知，將從發病病斑中分離的病原菌接種至健康玉米葉片后的發病癥狀與田間表現相似，分離后獲得的病原菌與原分離菌株相同，這些結果表示供試菌株C24為玉米葉斑病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

圖4 菌株C24對玉米葉片的致病性測定

菌株C24的rDNA-ITS保守序列擴增結果見圖5。參試樣品均能擴增出特異條帶。經NCBI網站比對可知，菌株C24的rDNA-ITS擴增序列與Curvularia及Cochliobolus屬中幾株真菌序列相似性較高。系統進化分析結果顯示(圖6)，供試菌株C24與 GenBank中的 Curvularia lunata strain CX-3、Cochliobolus geniculatus、Curvularia lunata isolate CL-1等親緣關系較近，其中與Curvularia lunata和Curvularia lunata strain CX-3序列同源性達到99%以上。結合形態學特征觀察，將致病菌鑒定為玉米彎孢霉菌(Curvularia lunata)，屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、彎孢屬、彎孢菌。

圖5 C24的ITS保守區PCR擴增電泳圖

2.5 不同培養基對菌株C24菌落生長的影響

圖6 基于菌株C24的rDNA-ITS序列構建的系統發育樹

圖7 不同培養基對菌株C24菌落生長的影響

不同培養基對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖7。菌株C24在PSA培養基、PDA培養基、Cza pek培養基、PSA＋玉米綠葉煎汁培養基、玉米綠葉煎汁培養基、PDA＋玉米綠葉煎汁培養基、燕麥培養基等7種培養基上，25℃恒溫下均能生長，然而不同培養基對菌落生長速度及形態影響差異顯著。其中在燕麥培養基上生長最快，且菌落致密平展，絨狀，菌落正面墨綠色，背面棕色，邊緣整齊，所以較適合該菌株菌落生長的是燕麥培養基，其次是玉米綠葉煎汁培養基，再次為PSA＋玉米綠葉煎汁培養基和PDA＋玉米綠葉煎汁培養基，整體來說，該菌株在這些培養基上形成的菌落形狀較不規則，邊緣不整齊；在Czapek培養基上菌落雖生長速度適中，但菌落不致密，氣生菌絲稀疏，灰白色；而在PDA培養基和PSA培養基上生長速度緩慢，這3種培養基均不適合菌落生長。同時試驗發現，病原菌在PSA、PDA、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁和Czapek培養基上易產孢，且在PDA上產孢量最多，而在PDA＋玉米綠葉煎汁和燕麥培養基上未見產孢，由此可知PDA培養基較適合該菌產孢。

2.6 不同溫度對菌株C24菌落生長的影響

不同溫度對玉米彎孢菌菌株C24菌落生長的影響見圖8。菌株C24在10～41℃均可生長，15℃以下時生長較慢，15～25℃該菌株的生長速度趨于穩定，而28～37℃生長速度最快，41℃時菌落生長速度有所下降。從結果推測C24適宜溫度較廣泛，相對更適合中溫偏高的環境。

2.7 不同pH值對參試菌C24菌落生長的影響

圖8 溫度對菌株C24菌落生長的影響

不同pH值對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖9。不同pH對菌落生長速度影響差異顯著。菌株C24在pH5～11均能生長，以pH 7～9菌落生長速度較快，而pH為5時該菌的生長速度最慢。

2.8 不同碳源對參試菌C24菌落生長的影響

不同碳源對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖10。試驗結果表明，病原菌除了在以木糖、乳糖、蔗糖為碳源的培養基上生長不好外，在其他培養基上都可以較好地生長，但在以麥芽糖為碳源的培養基上生長最快。此外，除在以麥芽糖為碳源的培養基上菌落生長速度快于無碳源的對照以外，在其他6種碳源培養基上的生長速度均低于對照，但其氣生菌絲密集度均高于對照；對照氣生菌絲極少且貼著培養基表面伸展生長，無氣生菌絲。而與無碳源的對照相比，碳源為可溶性淀粉和麥芽糖的培養基最適合菌落生長。

圖9 不同 pH對菌株C24菌落生長的影響

圖10 不同碳源對菌株C24菌落生長的影響

2.9 不同氮源對參試菌C24菌絲生長的影響

不同氮源對玉米彎孢菌株C24菌落生長影響見圖11。該菌株在含不同氮源的培養基上的生長速度存在顯著差異。與硝酸鈉對照相比，氮源為L-亮氨酸的培養基最適合該菌落生長，在以L-精氨酸為氮源的培養基上菌落生長速度最慢。試驗同時發現，菌株C24在以甘氨酸為氮源的固體培養基上產孢，在其它培養基未見產孢。

2.10 光照對參試菌C24菌落生長的影響

光照對玉米彎孢菌C24菌落生長的影響見圖12，與黑暗條件相比，光照對菌落生長影響顯著，說明光照有利于菌落生長。

3 討論

圖11 不同氮源對菌株C24菌落生長的影響

圖12 光照對菌株C24菌落生長的影響

本研究采用常規組織分離法對采集的玉米彎孢霉葉斑病的病原菌C24進行分離純化鑒定。結果表明，分離的病原菌C24接種至健康玉米葉片后，葉片產生的病斑與自然發病的病斑相同，且從發病的玉米葉片中分離出的病原菌與原分離菌株相同，結果顯示參試菌株C24為玉米彎孢霉葉斑病的病原菌。

通過對玉米彎孢霉葉斑病菌C24生物學特性進行研究可知，該病原菌在PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA＋玉米綠葉煎汁、燕麥等7種培養基上，25℃恒溫下均能生長，且在燕麥培養基上菌絲生長速度較快，而在PDA培養基和PSA培養基上菌落生長較慢。同時試驗發現，病原菌在PDA、PSA、玉米綠葉煎汁、PSA＋玉米綠葉煎汁和Czapek培養基上產孢，且在PDA培養基上產孢量最多，說明該培養基較適合孢子生長。結合培養基配制、菌絲生長速率、產孢情況等綜合分析，總體來說PDA培養基較為適合用于菌株C24的培養。

菌株C24的較適溫度在28～37℃。白元俊等關于玉米彎孢霉葉斑病菌的生物學特性研究表明，該菌最適溫度為30～32℃；白元俊等[15]、朱明旗等[16]關于玉米彎孢霉葉斑病的生物學特性研究表明，最適溫度為25～30℃，這與本研究結果略有差異；此外，張定法等[17]對玉米彎孢霉葉斑病生物學特性的研究表明，菌絲生長的適宜溫度為25～35℃，這與本研究結果基本一致，推測南繁區處于熱帶地區，常年高溫，導致病原菌彎孢霉適應較高溫天氣。

本研究發現，菌株C24適應pH范圍較廣，在pH 5～11均能生長，菌絲生長的最適pH為7～9，這與梅麗艷等[18]的研究結果略有差異，其研究表明，pH為6～8時適宜菌落生長，最適pH為7，pH為6～8時產孢量最大。

光照對菌株C24菌落的生長影響顯著。本研究結果顯示，光照有利于菌落生長，這與白元俊等[15]研究結果存在差異。

此外，不同的碳源和氮源對該病原菌的生長影響差異較大。與對照相比，以麥芽糖為碳源的培養基最適合該菌落生長，這與朱明旗等[16]的研究結果基本一致。氮源為 -亮氨酸的培養基最適合菌落生長，以 -精氨酸為氮源的培養基較不適合菌落生長，且病原菌只在以甘氨酸為氮源的固體培養基上產孢。

綜上所述，本研究結果與其他學者的研究結果既有相同之處又有不同之處，可能的原因是由于地域不同，導致病原菌的生物學特性有所差異。鑒于玉米彎孢霉葉斑病在玉米上造成較大危害，下一步工作重點對該病發生規律以及抗病品種培育等防治措施開展系統、深入的研究，以有效控制玉米彎孢霉葉斑病的危害。

4 結論

本研究以玉米彎孢霉葉斑病菌C24作為研究對象，對其進行生物學特性研究，得到該病原菌在燕麥培養基上生長最好，最適溫度在28～37℃，最適pH為7～9，光照有利于菌絲生長，碳源為麥芽糖、氮源為L-亮氨酸的培養基最適合該菌落生長。