多發性骨髓瘤患者骨髓組織中miRNA—181a、miRNA—373的表達及相關性分析

王嫻婷 鄭良達 解晶

[摘要] 目的 研究多發性骨髓瘤（MM）患者骨髓組織中微小RNA-181a（miRNA-181a）與miRNA-373的表達，探討其臨床意義。 方法 選取2015年3月～2017年3月浙江省臺州市第一人民醫院收治的67例MM患者作為病例組，選取同期患其他血液疾病的40例患者作為病例對照組、40例健康體檢人員作為健康對照組。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測各組骨髓組織中miRNA-181a及miRNA-373的表達，分析各組間兩者的表達差異及其與MM臨床病理特征的關系。Pearson線性相關分析分析miRNA-181a與miRNA-373表達的相關性。 結果 分別與病例對照組及健康對照組比較，病例組miRNA-181a表達明顯較高，miRNA-373表達明顯較低（P < 0.05），而病例對照組與健康對照組miRNA-181a、miRNA-373表達差異無統計學意義（P > 0.05）。病例組患者骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達與腫瘤分期、腫瘤分化有關（均P < 0.05），其與年齡、性別、細胞學分型及淋巴結轉移無關（均P > 0.05）。病例組骨髓組織中miRNA-181a與miRNA-373表達呈明顯負相關（r = -0.696，P < 0.05）。病例對照組和健康對照組的miRNA-181a與miRNA-373表達無相關性（r = 0.151、0.179，均P > 0.05）。 結論 MM骨髓組織中miRNA-181a表達升高，而miRNA-373表達降低，兩者共同參與腫瘤的發生、發展過程，可能成為新的MM診斷、治療及預后評估的標志物。

[關鍵詞] 多發骨髓瘤；微小RNA-181a；微小RNA-373；相關性

[中圖分類號] R733.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（b）-0085-05

Expression and correlation analysis of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of patients with multiple myeloma

WANG Xianting1 ZHENG Liangda1 XIE Jing2 JIANG Wenhua1

1.Department of Hematology and Oncology， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China； 2.Department of Laboratory， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of microRNA-181a （miRNA-181a） and miRNA-373 in bone marrow of patients with multiple myeloma （MM） and to explore its clinical significance. Methods A total of 67 patients with MM who were treated in Taizhou First People′s Hospital from March 2015 to March 2017 were selected as the case group， 40 patients with other blood diseases in the same period were selected as the case control group and 40 healthy people were selected as the healthy control group. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissues of each group. The differences in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between these groups and their correlation with clinicopathological features of MM were analysed. Pearson linear correlation analysis were used to show the correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression. Results Compared with the case control group and the healthy control group， the expression of miRNA-181a was significantly higher in the case group and the expression of miRNA-373 was significantly lower （P < 0.05）， but there was no difference in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between the case control group and the healthy control group （P > 0.05）. The expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of MM patients was related to tumor stage and tumor differentiation （P < 0.05）， but not related to age， gender， cytological type and lymph node metastasis （P > 0.05）. There was a significant negative correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression in the bone marrow of the case group （r = -0.696， P < 0.05）. There was no significant correlation between the case control group and the healthy control group （r = 0.151， 0.179， P > 0.05）. Conclusion The expression of miRNA-181a is increased in MM bone marrow tissue， and the expression of miRNA-373 is decreased. Both of them participate in the tumor development and progression， which may become a new marker for diagnosis， treatment and prognosis of MM.

[Key words] Multiple myeloma； MicroRNA-181a； MicroRNA-373； Correlation

多發性骨髓瘤（MM）是骨髓微環境中漿細胞的異常克隆增殖和血中高水平的單克隆免疫球蛋白，可造成骨性損害、貧血及腎臟損害，近年來MM發病率有逐漸增高的趨勢[1-2]。尋找可靠的MM腫瘤標志物，對于早期診斷、治療方案選擇及病情監測等具有重要意義[3]。微小RNA（miRNA）由18～25個核苷酸組成，研究[4]表明，MM患者骨髓組織中存在多種miRNA表達失調的現象，其參與調控腫瘤細胞的浸潤和遠處轉移。miRNA-181a是miR-181家族構成成員，該家族還包括miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d，其可通過靶向多種靶基因來調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化過程[5]。miRNA-373位于19q13.42，在多種腫瘤，如卵巢癌、多形膠質母細胞瘤等中均發現miRNA-373具有抑癌基因的功能，其可靶向rab22a等基因，抑制腫瘤細胞侵襲和轉移[6]。然而，目前關于miRNA-181a和miRNA-373在MM中的表達及與臨床病理特征的關系研究較少。本研究通過檢測MM患者骨髓組織中miRNA-181a和miRNA-373表達水平，分析兩者表達的相關性，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月～2017年3月浙江省臺州市第一人民醫院（以下簡稱“我院”）收治的67例MM患者作為病例組，選取同期診治的40例其他血液疾病患者作為病例對照組、40例骨髓穿刺證實骨髓功能正常的健康人群作為健康對照組。MM納入標準：①所有MM患者骨髓組織經病理診斷確診，MM的診斷符合國際骨髓瘤工作組（IMWG）2014年對MM診斷標準[7]；②臨床病理資料完整，患者及其家屬均知情同意并簽字；③患者均為首次診治，之前未接受過其他治療。排除標準：①合并其他器官系統的惡性腫瘤；②妊娠期或哺乳期婦女；③合并急性感染性疾病；④合并其他血液系統疾病。病例組男35例，女32例；年齡39～71歲，平均（57.4±7.2）歲；按照國際分期系統（ISS）進行分期，其中Ⅰ期29例，Ⅱ期25例，Ⅲ期13例。病例對照組男22例，女18例；年齡40～70歲，平均（59.2±6.3）歲；其中非霍奇金淋巴瘤13例，急性淋巴細胞白血病9例，慢性粒細胞白血病11例，慢性淋巴細胞白血病7例，該組患者診斷符合2007年《血液病診斷和療效標準》[8]。健康對照組男21例，女19例；年齡38～68歲，平均（57.0±6.8）歲。三組研究對象性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準同意。

1.2 檢測方法

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測各組miRNA-181a和miRNA-373的表達。采用Trizol法提取骨髓組織中總RNA，實驗步驟按照Trizol試劑盒說明書進行（購自美國Invitrogen公司，生產批號：127906）。以5 μL總RNA為模板進行反轉錄合成cDNA，應用TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒（購自美國ABI公司，生產批號：1203125）進行反轉錄。反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。得到cDNA后進行qRT-PCR反應。實驗步驟嚴格按照miRNA-181a和miRNA-373PCR試劑盒說明書進行（購自美國ABI公司，生產批號：20142322、20132618）。反應條件為：95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 10 s延伸，40個循環。miRNA-181a反轉錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAACTCAC-3′，正向引物序列：5′-GCG-GCGAACATTCAACGATG-3′，反向引物序列：5′-GTG-CAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-373反轉錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTGGATACGACACACCC-3′，正向引物序：5′-GGG-GAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反向引物序列：5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。內參基因U6反轉錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGATATGGAA-3′，上游序列：5′-ACACT-CCAGCTGGGATTCGTGAAGCG-3′，下游序列：3′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-5′。反轉錄引物、PCR引物和探針均購自ABI生物公司。所有反應均在ABI實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。采用相對Ct值進行數據分析，目的基因miR-181a/miRNA-373 mRNA的表達水平相對于內參基因U6的比值為2-ΔΔCt，計算miR-181a/miRNA-373的相對定量表達水平，其中ΔCt = CtmiR-181a/miRNA-373-CtU6。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），SNK-q法檢驗；相關性分析采用Pearson線性相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達比較

病例組、病例對照組及健康對照組骨髓組織中miRNA-181a的相對表達水平分別為（123.17±19.10）、（73.32±12.65）、（64.11±10.05）。病例組miRNA-181a表達顯著高于病例對照組及健康對照組（t = 3.458、3.679，P = 0.000、0.000），而病例對照組與健康對照組比較，差異無統計學意義（t = 0.247，P = 0.805）。病例組、病例對照組及健康對照組骨髓組織中miRNA-373的相對表達水平分別為（0.41±0.10）、（0.82±0.07）、（1.01±0.12），病例組miRNA-373表達顯著低于病例對照組及健康對照組（t = 2.114、2.613，P = 0.038、0.011），而病例對照組與健康對照組比較，差異無統計學意義（t = 0.529，P = 0.598）。見圖1。

2.2 病例組miRNA-181a、miRNA-373表達與MM臨床病理特征的相關性

病例組患者骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達與腫瘤分期、腫瘤分化有關（均P < 0.05），而其與年齡、性別、細胞學分型及淋巴結轉移無關（均P > 0.05）。見表1。

2.3 各組miRNA-181a、miRNA-373表達的相關性

病例組骨髓組織中miRNA-181a與miRNA-373表達呈顯著負相關（r = -0.696，P = 0.000）。見圖2。病例對照組和健康對照組miRNA-181a與miRNA-373表達無明顯相關性（r = 0.051、0.179，P = 0.206、0.097）。

3 討論

隨著對MM發病機制研究的不斷深入，尋找早期診斷、治療和判斷預后的腫瘤標志物是學者們研究的重點。非編碼RNA包括miRNA、lncRNA等，可以在RNA 水平行使各自的生物學功能。多種miRNA通過調節相關基因的表達參與MM的發生、發展病理生理過程。有學者[10]在體外細胞實驗中發現，骨髓瘤細胞miR-181a表達上調促進腫瘤細胞的增殖和遷移。本研究病例組miRNA-181a表達顯著高于病例對照組及健康對照組，而病例對照組及健康對照組的表達差異無統計學意義（P > 0.05），與以往研究[11]結果一致。其機制可能與腫瘤微環境中白細胞介素-1β（IL-1β）生成增加導致miRNA-181a表達上調有關，miRNA-181a結合下游抑癌基因PTEN mRNA的3′UTR區，抑制翻譯過程，促進腫瘤細胞增殖，當shRNA下調miRNA-181a表達后，其促進增殖的作用得到逆轉[12-13]。病例組患者骨髓組織中miRNA-181a表達與腫瘤分期、腫瘤分化有關，腫瘤分期越高，腫瘤分化越差，骨髓組織中miRNA-181a表達越高，與以往報道[14]一致。其機制可能是miRNA-181a高表達能顯著上調細胞周期的關鍵啟動因子Cyclin D，促進G1期向S期的轉換，導致腫瘤細胞異常增殖[15]。此外，miRNA-181a高表達激活PI3K-Akt信號轉導通路，促進下游基因表達，如微管蛋白的合成，進而促進腫瘤細胞遷移[16]。

研究[17]表明，位于染色體19q13.42的miRNA-373在腫瘤發生和轉移中起關鍵作用。本研究病例組患者的miRNA-373表達水平顯著低于病例對照組及健康對照組，而病例對照組與健康對照組miRNA-373表述無顯著差異，其機制可能是miRNA-373基因位點的雜合性缺失或基因表觀遺傳學修飾，如甲基化、泛素化等等引起的基因功能失活[18]。此外，RNA Pol Ⅲ負責miRNA的產生并有助于調節細胞的生物合成能力，某些作為聚合酶成分的因子如BRF2異常時，引起RNA Pol Ⅲ轉錄的失調，也可導致關鍵RNA的生成異常，導致細胞生長失控[19]。此外，腫瘤分期越高，腫瘤分化越差，骨髓組織中miRNA-373表達越低。其原因可能是miRNA-373在腫瘤的發生和發展中起抑制基因的作用，miRNA-373能抑制RAS通路中的幾個關鍵基因的表達，如RAB22A、RASSF1A等，進而抑制腫瘤細胞的增殖，當shRNA沉默miRNA-373表達后，其抑制增殖的作用消失[20]。miRNA-373能直接靶向LATS2，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[21-22]。此外，上皮間質轉化（EMT）對腫瘤的遷移和侵襲至關重要，miRNA-373表達顯著下調時，影響下游靶基因IRAK2與LAMP1的表達，導致EMT的上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達降低，間充質標志物N-鈣黏蛋白的表達增加[23]。此外，本研究中miRNA-181a與miRNA-373間表達呈顯著負相關，而兩者在病例對照組和健康對照組中的表達無明顯相關性。因此，miRNA-181a與miRNA-373可能通過腫瘤癌基因、抑癌基因及腫瘤細胞增殖的調控過程參與多發性骨髓瘤的發生、發展過程。

綜上所述，多發性骨髓瘤患者骨髓組織中miRNA-181a表達增加，而miRNA-373表達減少，兩者共同參與腫瘤的發生、發展過程，可能成為多發性骨髓瘤診斷、治療及預后評估的新的腫瘤標志物。但本研究樣本量少，兩者的具體作用機制尚待進一步研究。

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（收稿日期：2019-01-15 本文編輯：王 蕾）