MAPK通路介導Prx—1抑制硅沉著病小鼠肌成纖維細胞轉化

劉巖 洪凡 王朋

[摘要] 目的 探討絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在硫氧還蛋白過氧化物酶1（Prx-1）抗硅沉著病肌成纖維細胞轉化過程中的作用。 方法 將40只雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組（生理鹽水）、模型組[二氧化硅（SiO2）]、轉染對照組（SiO2+慢病毒載體）和Prx-1轉染組（SiO2+Prx-1慢病毒）。生理鹽水、SiO2及慢病毒均經支氣管灌注。造模后，小鼠常規飼養12周。采用免疫組化法和免疫熒光法分別檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）表達。Western blot法檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原、Prx-1、磷酸化細胞外信號調節激酶（p-ERK1/2）、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（P-p38）、磷酸化氨基末端激酶（p-JNK）表達。 結果 模型組和轉染對照組可見矽結節和肺間質纖維化，但Prx-1轉染組的上述病變減輕。模型組和轉染對照組Prx-1表達無區別，但Prx-1轉染組較模型組Prx-1表達增高。與對照組比較，其余各組肺組織α-SMA、8-OHdG、Ⅰ型及Ⅲ型膠原、p-ERK1/2、p-P38、p-JNK表達增多；與模型組和轉染對照組比較，Prx-1轉染組的上述指標表達減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）。 結論 Prx-1具有抑制SiO2誘導的肌成纖維細胞轉化和肺纖維化作用，這種作用與降低活性氧并抑制MAPK通路活化有關。

[關鍵詞] 肌成纖維細胞轉化；硫氧還蛋白過氧化物酶1；活性氧；絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號] R135.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0025-05

MAPK pathway mediates the ability of Prx-1 to inhibite myofibroblast transformation in mice with silicosis

LIU Yan HONG Fan WANG Peng LI Qian BAI Zhaorong SUN Ying▲

Department of Pathology， School of Basic Medical Science， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063210， China

[Abstract] Objective To investigate the role of mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway in the transformation of thioredoxin peroxidase-1 （Prx-1） against myofibroblasts of silicosis. Methods Forty male C57BL/6 mice were randomly divided into control group （saline）， model group （SiO2）， transfection control group （SiO2 + lentivirus vector） and PRX-1 transfection group （SiO2 + Prx-1 lentivirus）. Normal saline， SiO2 and lentivirus were perfused through bronchus. After modeling， mice were fed for 12 weeks. Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） respectively. Western blot was used to detect the expression of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， Prx-1， phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （p-ERK1/2）， phosphorylated-mitogen-activated protein kinase p38 （P-p38） and phosphorylated amino-terminal kinase （p-JNK）. Results Silicon nodules and pulmonary interstitial fibrosis were found in model group and transfection control group， but the lesions were alleviated in Prx-1 transfection group. There was no difference in Prx-1 expression between model group and transfection control group， but compared with model group， Prx-1 expression increased in Prx-1 transfection group. Compared with control group， the expression of α-SMA， 8-OHdG， collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ， p-ERK1/2， p-P38 and p-JNK were increased in lung tissue of the other groups. Compared with the model group and the transfection control group， the expression of the above indicators in the Prx-1 transfection group were decreased. Conclusion Prx-1 can inhibit SiO2-induced myofibroblast transformation and pulmonary fibrosis， which is related to the reduction of oxygen-active substances and the inhibition of activation of MAPK pathway.

[Key words] Myofibroblast transformation； Thioredoxin peroxidase 1； Reactive oxygen species； Mitogen-activated protein kinase

硅沉著病是由長期吸入二氧化硅（SiO2）而引起的一種肺纖維化性疾病。在纖維化過程中，肺成纖維細胞可轉化為肌成纖維細胞，從而獲得遷移能力及更強的合成膠原能力[1]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）及其介導的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）傳導通路在這一轉化中發揮著重要的促進作用[2-3]。硫氧還蛋白過氧化物酶-1（peroxiredoxin-1，Prx-1）是一種新型過氧化物酶，前期研究發現Prx-1通過降低ROS抑制來肌成纖維細胞分化，抗硅沉著病纖維化形成[4]。然而，Prx-1如何抑制肌成纖維細胞轉化，目前并不清楚。本研究利用小鼠硅沉著病模型，觀察Prx-1對SiO2誘導的肺肌成纖維細胞轉化及膠原合成的影響，并探討MAKP通路的作用，為進一步明確Prx-1抗硅沉著病纖維化作用提供參考。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2014-0004，動物合格證號11401300075648。小鼠常規飼養于華北理工大學醫學實驗中心潔凈級動物房[SYXK（冀）2015-0038]。溫度22～25℃，相對濕度40%～60%，晝夜替換12/12 h，自由進食飲水。本研究經華北理工大學動物倫理委員會批準（華北理工大學動物倫理審批號：2015050）。

1.2 主要試劑

SiO2粉塵（美國sigma公司）；Prx-1慢病毒（蘇州吉瑪公司）；8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）抗體、Prx-1抗體及人α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（美國Abcam公司，生產批號：307233-9、282828-11、YH160753）；Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體（P-p38）抗體（美國Affinity公司，生產批號：122712、15217、2111740）；磷酸化的細胞外信號調節激酶（p-ERK1/2）抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）抗體（美國BD公司，生產批號：4038733、155642-16）。

1.3 分組

采用摸球法將小鼠隨機分為對照組、模型組、轉染對照組和Prx-1轉染組，每組10只。對照組小鼠經支氣管灌注生理鹽水200 μL，模型組小鼠以相同方式給予50 mg/mL SiO2 200 μL，轉染對照組給予SiO2懸液與慢病毒載體（107 TU/只），Prx-1轉染組灌注SiO2懸液與Prx-1慢病毒（107 TU/只）。模型制備后，普通飼養12周。

1.4 HE染色

造模并普通飼養12周末，麻醉小鼠，取出肺組織，左肺固定于4%多聚甲醛，常規石蠟包埋，HE染色。

1.5 免疫組織化學法檢測α-SMA表達

肺組織切片水化、修復和血清封閉后，α-SMA Ⅰ抗（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，次日Ⅱ抗孵育、DAB顯色和蘇木精復染。結果判斷：每張切片隨機選取5個高倍視野，以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞比例評分：<5%（0分），5%～25%（1分），>25%～50%（2分），>50%～75%（3分），>75%（4分）。染色強度評分：無著色（0分），淺棕黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）。陽性細胞比例和染色強度的乘積為α-SMA染色評分[5]。

1.6 免疫熒光法檢測8-OHdG水平

肺組織切片水化、修復及封閉后，8-OHdG Ⅰ抗4℃孵育過夜；次日Ⅱ抗避光室溫孵育、封片。熒光顯微鏡下每張切片隨機選取5個高倍視野，Image-Pro Plus 6.0軟件檢測積分光密度值（IOD），以平均值為8-OHdG表達水平。

1.7 免疫印跡法檢測Prx-1、p-ERK1/2、p-JNK、P-p38及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達水平

右肺組織經裂解、離心后收集上清。40 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜，相應Ⅰ抗4℃孵育過夜，次日Ⅱ抗室溫孵育后電化學發光（ECL）顯影，Image J軟件行灰度掃描。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理變化及α-SMA表達

對照組肺組織結構完整，肺泡壁薄，無明顯炎癥細胞滲出。模型組和轉染對照組的肺組織結構紊亂，肺泡間隔增寬，可見細胞-纖維性矽結節。與模型組比較，Prx-1轉染組肺泡間隔變窄，矽結節數量及面積減小。

α-SMA主要分布在矽結節和肺泡間隔。與對照組比較，模型組α-SMA表達升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。轉染對照組和模型組α-SMA表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；Prx-1轉染組α-SMA表達較模型組下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達

與對照組比較，模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。轉染對照組和模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達差異無統計學意義（P > 0.05），但Prx-1轉染組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2、表1。

2.3 各組小鼠肺組織8-OHdG水平

8-OHdG是一種DNA過氧化產物，其形成后由細胞核轉至細胞漿，但由于其不能通過細胞膜或被降解，可穩定地存在于細胞漿，故可準確地反映ROS水平[6]。本研究中8-OHdG呈綠色熒光，對照組8-OhdG表達極少，模型組表達增多，主要位于矽結節和肺泡間隔；兩組8-OhdG表達比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，轉染對照組8-OhdG表達差異無統計學意義（P > 0.05），但Prx-1轉染組8-OhdG表達明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3、表1。

2.4 各組小鼠肺組織Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK的表達

各組ERK1/2、p38和JNK表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。與對照組比較，模型組Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK表達增多（均P < 0.05）。轉染對照組與模型組的上述指標表達差異無統計學意義（P > 0.05），但與模型組比較，Prx-1轉染組Prx-1水平增高，p-ERK1/2、P-p38及p-JNK水平下降，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見圖4、表1。

3 討論

硅沉著病的主要病理特點是矽結節形成和肺間質纖維化，肌成纖維細胞在硅沉著病形成中發揮重要促進作用[7]。肌成纖維細胞是一種含有肌動蛋白和肌球蛋白等蛋白質的成纖維樣細胞，因其分泌膠原能力強，被認為是促進器官纖維化形成過程中最重要和最主要的細胞之一[1，8]。成纖維細胞數量在正常肺組織中肌很少，TGF-β1等細胞因子可誘導肺成纖維細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞等細胞轉化為肌成纖維細胞，ROS介導的MAPK通路活化參與這一轉化過程[9-10]。Lai等[11]報道TGF-β1通過ROS/P38和ROS/JNK通路激活Notch3，導致成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。Wu等[12]報道蓽茇酰胺（一種中藥提取的單體物質）可有效降低血管緊張素Ⅱ誘導心臟成纖維細胞ROS增多，并通過抑制ROS/ERK1/2通路抑制成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，最終抑制膠原合成，提示ROS/ERK1/2通路在心臟肌成纖維細胞轉化中具有促進作用。

SiO2粉塵本身及SiO2激活的肺泡巨噬細胞均可產生ROS[13-14]。本研究中，與對照組比較，模型組小鼠肺泡間隔增寬，可見矽結節形成，Ⅰ/Ⅲ型膠原和8-OHdG表達水平升高，提示硅沉著病形成過程中ROS生成增多。成纖維細胞轉化為肌成纖維化細胞的重要標志是α-SMA在成纖維細胞中表達很低，但在肌成纖維化細胞中高表達[1]。本研究中模型組α-SMA表達明顯高于對照組，且主要存在于矽結節和肺泡間隔內，同時伴隨ERK1/2、JNK及p38通路的激活，提示SiO2誘導ROS生成后，ROS/MAPK通路及肌成纖維化細胞轉化間可能有密切聯系。

Prx-1是一種新型抗過氧化物酶，可有效降低ROS水平，并抑制ROS介導的細胞內信號傳導通路的活化[15-17]。既往報道[4，18-20]指出，Prx-1具有抗硅沉著病纖維化作用。本研究中，Prx-1轉染組Prx-1表達較模型組明顯增高，提示Prx-1慢病毒轉染后的肺組織Prx-1高表達。與模型組比較，Prx-1轉染組α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原表達降低，同時8-OHdG、p-ERK1/2、P-p38和p-JNK水平也明顯降低，說明Prx-1通過降低ROS抑制MAPK通路活化，從而抑制肌成纖維細胞的轉化和膠原合成。

綜上所述，Prx-1具有抑制SiO2誘導的肌成纖維細胞轉化和肺纖維化形成，這種抑制作用與降低ROS并抑制MAPK通路活化有關。

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（收稿日期：2018-11-05 本文編輯：王 蕾）